mathi.asparagine Posted February 6 Share Posted February 6 Bonjour ! Je pense qu'il y a quelque chose que je n'ai pas bien compris, comment on peut dénombrer les cellules sécrétrices en ELISPOT par exemple ? Car celles-ci ne vont sécréter qu'un seul antigène donc quand on les mettra en évidence ça nous donnera pas le nombre de cellules sécrétrices si ? Pareil pour la cyrtométrie en flux: si on a une stimulation polyclonale grâce au PMA et la ionomycine comment peut on déterminer le nombre de LT de départ ? Est ce que quelqu'un pourrait m'éclairer svp ? Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Solution AshGrey Posted February 6 Solution Share Posted February 6 Hello, désolé mais je peux te répondre que pour le ELISPOT. Comme tu l'as dit lorsque l'antigène va être détecter et qu'on met le substrat etc, les cellules sur lesquelles les anticorps se sont fixés vont être coloré. Ca va donner un truc de ce genre : https://zupimages.net/viewer.php?id=24/06/n59c.png donc à partir de ce moment là, tu peux compter les cellules. Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Cicatrix Posted February 6 Share Posted February 6 (edited) saluut petit complément : j'ai compris qu'on comptait le nombre de spots, c'est-à-dire le nombre de lieux où des antigènes ont été sécrétés, et comme les cellules ne bougent pas ça fait un point/spot par cellule !! (parce que c'est vrai que les cellules doivent chacune sécréter plusieurs protéines donc ça ferait trop de points par rapport au nombre de cellules) edit : je viens de lire ton message @AshGrey est ce que les antigènes restent attachés aux cellules ? c'est pour ça qu'un spot = une cellule ?? il y a une heure, mathi.asparagine a dit : pour la cyrtométrie en flux: si on a une stimulation polyclonale grâce au PMA et la ionomycine comment peut on déterminer le nombre de LT de départ ? pour cette technique je pense que le but n'est pas de déterminer le nombre de LT mais de connaitre la fonction (?) à la fin on connait ce que les LT ont exprimé, et leur proportion en pourcentages... Edited February 6 by Cicatrix Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
AshGrey Posted February 6 Share Posted February 6 Désolé @Cicatrix, j'ai fait un abus de langage, non les antigènes restent pas attaché aux cellules puisqu'ils sont justement sécrétés et les anticorps sont pas attachés non plus aux cellules. les cellules sont éliminées avant la révélation par substrat. Les antigènes restent plutôt attaché sur les anticorps mais puisque les antigènes provenait de la cellule, on comptes les cellules mais indirectement. Donc normalement à moins que je me trompe si c'est le cas je m'excuse, un spot = une cellule. J'ai vu qu'un.e tuteur.rice est en train d'écire je crois donc elle/il apportera sans doute des explications plus clairs. Cicatrix 1 Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Tuteur Léon Posted February 6 Tuteur Share Posted February 6 Salut @mathi.asparagine ! Pour ta première question @AshGrey a parfaitement répondu, c'est totalement ça. Par rapport à la deuxième @Cicatrix a aussi géré, mais si tu veux plus de détails, il faut que tu soit plus précis sur le contexte de ta question. Le principe de base de la cytométrie en flux c'est de trier des cellules, et si je ne m'abuse pas, il n'y a pas forcément de stimulation polyclonale avant de la faire, ce qui fait qu'on reste bien avec notre nombre de cellule de départ. Cicatrix and Lulu_le_Fou 1 1 Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
mathi.asparagine Posted February 6 Author Share Posted February 6 D'accord merci beaucoup à vous 3 ça fait beaucoup plus sens !! Cicatrix 1 Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Cicatrix Posted February 6 Share Posted February 6 il y a 36 minutes, AshGrey a dit : Désolé @Cicatrix, j'ai fait un abus de langage, non les antigènes restent pas attaché aux cellules puisqu'ils sont justement sécrétés et les anticorps sont pas attachés non plus aux cellules. les cellules sont éliminées avant la révélation par substrat. Les antigènes restent plutôt attaché sur les anticorps mais puisque les antigènes provenait de la cellule, on comptes les cellules mais indirectement. Donc normalement à moins que je me trompe si c'est le cas je m'excuse, un spot = une cellule. J'ai vu qu'un.e tuteur.rice est en train d'écire je crois donc elle/il apportera sans doute des explications plus clairs. ok mercii tu gères <3 il y a 18 minutes, Léon a dit : Par rapport à la deuxième @Cicatrix a aussi géré, mais si tu veux plus de détails, je suis flattée merci xD Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Tuteur La_Mouche Posted February 7 Tuteur Share Posted February 7 (edited) Le 06/02/2024 à 18:24, mathi.asparagine a dit : si on a une stimulation polyclonale grâce au PMA et la ionomycine comment peut on déterminer le nombre de LT de départ ? Salut ! J'apporte des précisions sur cette question : En cytométrie en flux tu vas identifier les caractéristiques d'un amas de cellules : granularité, taille, protéines de surface ou intra-cellulaires... Pour ce faire, on analyse la réponse des molécules à la lumière. On regarde l'absorption, la diffusion, la fluorescence (par un fluorochrome ou un anticorps par ex). Chaque molécule va absorber ou diffuser différemment selon sa structure. Tu vas ainsi pouvoir analyser jusqu'à 30 paramètres simultanément. Je récapépète juste la méthode de cytométrie en flux : les cellules sont en suspension dans un liquide et arrivent à la queuleuleu via un veine flexible sous pression qui aura pour effet d’aligner et d'espacer les cellules en vue de l’analyse. Nos petites cellules passent dans un système optique composé de lasers (pour envoyer la lumière), de filtres (pour sélectionner une longueur d'onde spécifique par ex lorsqu'on excite un fluorochrome fixé à un anticorps lui même fixé à un antigène ;) et de miroirs ou photomultiplicateurs (pour amplifier les signaux). Chaque molécule réagit différemment et les signaux optiques sont ensuite convertis en signaux électroniques et analysés par un ordinateur. Pour en venir au fait qui nous intéresse : La stimulation polyclonale par le PMA et la ionomycine va activer les LT. Cette activation va amener les LT à exprimer et à synthétiser des cytokines qui permettront des les caractériser. Donc je pense que le cours cite PMA et ionomycine car ils vont permettre d'analyser plus de marqueurs de différenciation que simplement CD8 ou CD4. Car les LT peuvent encore être divisés en sous classes selon leurs protéines de surface ou les cytokines qu'ils sécrètent. Et pour la multiplication cellulaire qui suit l'activation des LT, ce n'est pas un problème car ils ne sont stimulés que pendant 4h, ce qui n'est pas suffisant pour les faire proliférer. Donc on pourra tout de même les compter. Voici un exemple de cytométrie en flux dans laquelle les LT sont activés par du PMA et la ionomycine pour induire l'expression de cytokines : J'espère que c'est plus clair, n'hésite pas si tu as une question supplémentaire ! Article qui explique tout en détail : https://rea.revuesonline.com/articles/lvrea/pdf/2017/07/lvrea266p517.pdf Post du forum qui explique les étapes de la cytométrie en flux : Edited February 8 by La_Mouche j'avais fait une erreur notoire que j'ai modifié après discussion avec Pr Segui Cicatrix, mathi.asparagine and Lulu_le_Fou 2 1 Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
mathi.asparagine Posted February 7 Author Share Posted February 7 Merci beaucoup à toi !! Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
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