Question sur les différent types de microscopie

[Meriem]

Bonjour, je suis venue tout à l’heure en perm car je ne comprend pas comment est ce que on peut différencier les différents type de microscopie par exemple la différence entre contraste de phase et interférentiel alors qu’ils sont fait de la même manière .

 

[Moustache]

Révélation

@Spirou time to shine 

 

[Spirou]

Holààà @Meriem désolé pour le temps, je vais te réexpliquer tout ça,

 

Techniques de visualisation : 

1. - Microscopie Optique : Technique utilisant la lumière visible pour observer des échantillons.
2. - Microscopie Electronique : Technique d'imagerie utilisant des faisceaux d'électrons au lieu de la lumière pour obtenir des images de haute résolution.
3. - Microscopie Confocale (MO) :  Permet de visualiser les molécules fluorescentes. Technique d'imagerie optique qui utilise un diaphragme confocal pour éliminer la lumière hors du point focal, permettant une visualisation tridimensionnelle de structures biologiques.
4. - Microscopie Biphotonique (MO) : Permet de visualiser les molécules fluorescentes. Technique d'imagerie optique utilisant deux photons simultanés pour exciter les fluorophores.

 

1 - Microscopie Optique : La lumière pour observer des échantillons biologiques requiert la coloration des cellules, cette coloration peut entraîner la mort cellulaire. Pour observer des cellules vivantes des techniques sont employées :

• Contraste de Phase :

Exploite les différences de phase de la lumière qui passe à travers différentes parties d'un échantillon transparent. Elle utilise une plaque de phase, qui crée des variations dans le faisceau lumineux. Ces variations de phase sont converties en variations d'intensité, ce qui crée un contraste entre les différentes parties de l'échantillon.

 

• Microscopie en Contraste Interférentiel (Nomarski) :

Utilise des faisceaux de lumière divisés et déphasés. Ces faisceaux interfèrent lorsque la lumière passe à travers l'échantillon, créant un motif de contraste qui dépend des variations d'épaisseur, de densité et d'indice de réfraction dans l'échantillon.

 

• Fond Noir :

Source lumineuse positionnée sur le côté de l'échantillon plutôt que directement en dessous => éclairage latéral, lorsque la lumière traverse l'échantillon, elle est déviée par les structures présentes dans l'échantillon. Les parties de l'échantillon qui dévient la lumière sont rendues plus lumineuses, tandis que les parties qui la laissent passer restent sombres => Création d'une image nette et contrastée de l'échantillon sur un fond noir. 

 

• Microscope à Polarisation :

Type de microscope qui utilise des filtres polariseurs pour contrôler la direction de la lumière qui atteint l'échantillon. En combinant deux filtres polariseurs croisés, on peut éliminer la lumière non polarisée, ne laissant passer que la lumière polarisée. Lorsque la lumière polarisée traverse un matériau biréfringent, elle est déviée selon la direction de biréfringence du matériau. Cela crée des variations de luminosité et de couleur dans l'image observée.
Utile pour visualiser les microtubules, microfilaments, et membranes lipidiques dans des échantillons biologiques.

 

 

2 - Microscopie Électronique : 

• Balayage classique (SEM : SCANNING ELECTRON MICROSCOPE) : Observation d'échantillons biologiques épais.

Après fixation et déshydratation, l'échantillon est métallisé avant d'être balayé sous vide par un fin faisceau d'électrons. Les électrons secondaires émis sont mesurés pour créer une image 3D sur un écran d'ordinateur. Bien que le SEM produise des images fortement agrandies avec une profondeur de champ importante, sa résolution est moindre par rapport au microscope électronique à transmission (ci dessous). Le procédé implique la déshydratation et la métallisation, présentant un risque d'artefacts.

 

• Transim (TEM : TRANSMISSION ELEC-TRON MICROSCOPE) : Observation du relief et des surfaces des échantillons biologiques via cryofracture ou cryodécapage, suivies d'un ombrage métallique pour la visualisation. 

Cryofracture : Congélation en azote liquide avec cryoprotecteur. Fracturation, révélant la structure des membranes cellulaires.

Cryodécapage :Étapes similaires à la cryofracture, SANS cryoprotecteur.

 

Visualisation par Ombrage Métallique : Dépôt sur support, atomisation latérale d'un métal lourd (or, platine) pour ombrer la surface exposée -> Réalisation d'une réplique par dépôt de film de carbone -> Dissolution de l'échantillon organique, observation en microscopie à transmission.

(La coloration négative est une Alternative à l'ombrage métallique pour souligner les contours. Incubation de l'échantillon avec une solution de sels de métal lourd. Lavage pour obtenir une image en négatif.)

 

 

3 - Microscopie Confocale :  Utilisation de diaphragme placé dans un plan focal conjugué à celui de l’objectif (confocal) pour éliminer la fluorescence parasite hors du point focal, favorisant ainsi la reconstruction tridimensionnelle par des balayages successifs de plans de coupes. Permet l'observation directe de sections spécifiques d'échantillons épais jusqu'à 50μm, mais présente une profondeur de champ limitée à 600 nm. L'utilisation du laser peut causer des photo-dommages, restreignant l'observation en direct d'échantillons vivants.

 

 

4- Microscopie Biphotonique : Concentration de photons dans un très petit volume pour avoir l'excitation biphotonique. Très grande résolution spatiale dans les trois dimensions grâce au confinement intrinsèque de la fluorescence au point focal. PAS DE DIAPHRAGME donc incorrect de parler de microscope confocal biphotonique.

Principal avantage du microscope biphotonique : restriction des éventuels dommages au point de focalisation, due à la localisation de l’excitation.

 

 

TABLEAU RECAP :

 

 

Objectif d'Observation	Technique en Microscopie Optique (MO)	Technique en Microscopie Électronique (ME)
Aspect de Relief	Microscopie Optique (MO) - Nomarsky	(+++ Utilisation de MO pour le relief)
	Microscope Confocal (MO)
	Microscope Biphotonique (MO)
Mouvement Cellulaire	MO sans coloration	Microscopie Électronique à Transmission (TEM)
	Confocal (Biphotonique) + GFP (molécules)	Microscopie Cryoélectronique
		Microscopie Électronique à Balayage (SEM)
Observation de Molécules Individuellement	TEM +/- Ombrage ou Coloration Négative	Immunohisto(cyto)chimie (Immunomarquages à l'or colloïdal, à la ferritine)
Localisation Moléculaire (Immunomarquage)	Immunoenzymologie, Immunofluorescence
	Confocal (Biphotonique) + GFP (molécules)
Séquence Génomique / Expression Génique	Hybridation In Situ (MO/E)
Mouvements Moléculaires dans la Cellule Vivante	Confocal (ou Biphotonique) + GFP
	FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

 

Révélation

@Moustache tu m'as mis la pression..

 

 

Edited December 1, 2023 by Spirou

[Moustache]

il y a 11 minutes, Spirou a dit :

 

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@Moustache tu m'as mis la pression..

 

Révélation

mdrr ça en valait la peine vu la réponse au top 

 

 

[Meriem]

Merci beaucoup ça me parait plus clair maintenant !!