RT PCR

[PassD]

Salut, j’ai un petit problème sur le QCM 7 du TD 2 de génome : 

 

On souhaite amplifier l’ADN génomique et les ARN totaux pour pouvoir les comparer et déterminer si il y a epissage alternatif ou pas.
Mais pour cela il faut que nos couple d’amorces délimitent dans les 2 cas (ADN génomique et ARN totaux) les meme exons sinon on ne pourrait ps comparer les résultats obtenu par électrophorese. 
 

Pour mieux expliquer j’ai pris l’exemple du couple 1 d’amorce qui est présenté comme ceci dans l’énoncé : Une amorce sens situé en 5’ de l’exon 1 et une amorce anti sens situé en 5´de l’exon 4 

 

Lorsqu’on veut amplifier l’ADN génomique double brin voilà ce qu’on a avec nos amorces : 

E= exon et I = intron 

5’ [E1] [I1][E2][I2][E3][I3][E4][I4] 3’

    5’->
              AMPLIFICATION                    
                                            <-5’
3’ [E1][I1][E2][I2][E3][I3][E4][I4] 5’

 

donc voilà pour l’ADN génomique nos amorces délimitent 4 exons (et 4 introns)

 

 

 

Maintenant lorsqu’on veut amplifier les ARN totaux, de ce que j’ai compris on part d’un ARNm mature(simple brin) ne contenant que des exons ensuite on transforme cet ARN en ADN grâce à une reverse transcriptase et on obtient:

 1 SEUL BRIN D’ADN ne codant que pour des exons : 

Donc maintenant si on utilise notre couple 1 ( qui je rappelle est composé d’une Amorce sens en 5’ de l’exon 1 et une amorce anti sens de l’exon 4) voici ce qu’on a : 

 

 

5’[exon1][exon2][exon3] 5’[exon4] 3’

    ->    AMPLIFICATION    <-  

 

Avec le couple 1 amorce on ne délimite seulement 3 exons pour les ARN totaux 

 

Et voilà le problème pour l’ADN génomique les amorces délimitent 4 exons et là pour l’ ADN obtenu après reverse transcriptase nos amorce ne délimitent que 3 exons. 

je sais pas si j’ai bien expliqué ce qui me posait problème mais si qlq pourrait m’expliquer là où je fais fausse route je suis preneur

 

 

 

[Vector]

helloo !

 

Est-ce que tu peux préciser la correction apportée par le.la chargé.e de TD et ce qui te pose problème ?

(pour être sûr de pas répondre a coté et de pas t'embrouiller)

[Vector]

heeey c'est encore moi !

 

J'ai réfléchis à ta question et ça m'embête de te laisser sans réponse du coup me revoilà.

 

Je pense qu'il y a juste un petit problème dans le placement de tes amorces pour l'amplification de l'ADN : tu as mis les amorces dans le même sens que les brins matrices (le 5' en face du 5') alors que les amorces doivent être antiparallèles !! 

 

Et en ce qui concerne ces histoires d'exons, voila comment j'aurais procédé :

 

Amplification de l'ADN génomique : (ADN génomique en bleu, amorces en rouge et ADN en vert)

 

5'- [E1] [I1] [E2] [I2] [E3] [I3] [E4] [I4] -3'

3'- [E1] [I1] [E2] [I2] [E3] [I3] <- 5'                         => 3 exons (1, 2 et 3) et 3 introns (1, 2 et 3)

 

     5' -> [I1] [E2] [I2] [E3] [I3] [E4] [I4] -3'           => 3 exons (2, 3 et 4) et 4 introns (1, 2, 3 et 4)

3'- [E1] [I1] [E2] [I2] [E3] [I3] [E4] [I4] - 5'

 

Je pense que ton problème vient juste d'un mauvais placement de tes amorces. Quand on dit qu'une amorce ce place en 5' d'un exon, ça veut dire qu'elle se place à son extrémité 5' (comme tu l'as bien montré pour l'amplification de l'ADNc), mais comme les amorces sont antiparallèles, il n'y aura pas d'amplification de cet exon. Petit exemple pour comprendre (j'ai pris des séquences au hasard) : on a fait un zoom au niveau de l'exon 1 et de l'intron 1

 

3'                      Exon 1                    5'    3'                   Intron 1                    5'

ATCGTTACCAGTACGTACGTTCGA      ACGTTGCAACGTACCCAACGTCG

                                            CAAGCT ->TGCAACGTTGCATGGGTTGCAGC

                                        5' amorce 3'

 

Mon amorce si situe bien en 5' de mon exon 1, mais ma synthèse d'ADN commence à l'intron 1 (donc pas d'amplification de l'exon 1 : c'est pour ça que tu te retrouves avec 3 exons et pas 4)

 

voila j'espère que ça a répondu à ton petit problème, n'hésite pas si quelque chose n'est pas clair !

 

La tutobise