enzymes

[Mels]

bonjour, vous pouvez m'expliquer prq cet item est vrai ? "Il est possible d’isoler le promoteur eucaryote de pPASS à l’aide des enzymes BamH1 et Pst1 puis d’ouvrir ensuite le plasmide pGFP à l’aide de ces mêmes enzymes afin d’insérer le promoteur"

 

j'ai mis que c'était faux pcq y'avait deux BAMH1 et du coup pour moi, bah on pouvait pas savoir lequel prendre pcq l'un d'eux 

accompagné de PST1 nous permet d'avoir le fragment qu'on veut alors que l'autre non ,il nous donne rien du tout !! 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Mels, 

Alors ton raisonnement est correct dans le sens où effectivement en coupant par BamH1 et Pst1 on aura 3 fragments : 

- un fragment 1 de : 1600 - 1500 = 100 pb (qui ne contient pas l’insert)

- un fragment 2 de : 1500 - 800 = 700 pb (qui contient l’insert)

- un fragment 3 de : 3200 - (700 + 100) = 2400 pb (qui ne contient pas l’insert)

 

Pour autant dans le qcm on te demande si on peut cloner le fragment d’intérêt en utilisant BamH1 et Pst1

La réponse est oui, on peut

Certains plasmides auront intégré le fragment 1, d’autres auront intégré le fragment 2 (je ne te parle pas du fragment 3 volontairement parce qu’il est particulier de part le fait qu’il contienne la séquence ORI)

Ceux qui auront intégré le fragment 1 n’auront pas le promoteur tissu spécifique eucaryote, par contre, ceux qui auront intégré le fragment 2 l’auront 

Le sens de la question ce n’était pas « est-ce qu’on va seulement avoir 1 type de plasmide recombinant qui contient le promoteur » mais « est-ce qu’on peut obtenir le plasmide recombinant que l’on veut grâce à ces deux enzymes » -> la réponse est oui 

 

Tu comprends mieux ? 

[Mels]

ok je comprends mieux, merci. j'ai bloqué mtn avec l'item suivant qui lui aussi est considéré vrai (du coup pas de correction...): "Après insertion du promoteur à l’aide de BamH1 et Pst1, la digestion par HindIII du plasmide pGFP permet d’obtenir 4 fragments respectivement de 110, 310, 1630 et 3800pb"

tu pourrais m'expliquer comment ils ont fait pour les calculer ? je suis d'accord avec le fait qu'il y aie 4 fragments et tout et j'ai meme reussi à en avoir 2/4  mais pour le reste j'y arrive pas !!! 

[Cassolnousmanque2]

@Mels

yes bien sûr je reprends cette partie 

Alors déjà voilà le plasmide recombinant que tu obtiens (en vert l’insert, en rose les sites HindIII) 

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/07/hhf2.jpeg

1er fragment : 1310 - 1200 = 110 pb 

2e fragment : 1620 - 1310 = 310 pb 

3e fragment : 3250 - 1620 = 1630 pb 

4e fragment :  5850 - 3250 + 1200 = 3800 pb 

 

Je pense que tu as oublié de modifier la position des sites de restriction dans le plasmide recombinant, c’est pour ça que tu ne trouvais pas les bonnes tailles pour les deux derniers

[Mels]

prq t passée de 810 à 1310 pb et de 1120 et 1620 pb ?? c pour ca que je me suis trompée ! merci bcp mais tu pourrais juste me dire prq tu as rajouté des pb ? 

[Cassolnousmanque2]

@Mels, 

alors il faut que tu calcules la position relative de tes sites de restriction sur ton insert : 

 

- distance entre HindIII et BamH1 dans pPASS = 810 - 800 = 10 pb

-> on ajoutera + 10 pb à la position de BamH1 dans pGFP recombinant pour avoir la position de HindIII 

=> nouvelle position de HindIII = 1300 + 10 = 1310 pb 

 

- distance entre EcoR1 et BamH1 dans pPASS = 820 - 800 = 20 pb

-> on ajoutera + 20 pb à la position de BamH1 dans pGFP recombinant pour avoir la position de EcoR1

=> nouvelle position de EcoR1 = 1300 + 20 = 1320 pb

 

- distance entre Xho1 et BamH1 dans pPASS = 830 - 800 = 30 pb

-> on ajoutera + 30 pb à la position de BamH1 dans pGFP recombinant pour avoir la position de Xho1

=> nouvelle position de Xho1 = 1300 + 30 = 1330 pb 

 

- distance entre HindIII et BamH1 dans pPASS = 1120 - 800 = 320 pb

-> on ajoutera + 320 pb à la position de BamH1 dans pGFP recombinant pour avoir la position de HindIII 

=> nouvelle position de HindIII = 1300 + 320 = 1620 pb

 

- distance entre HindIII et Pst1 dans pPASS = 2600 - 1350 = 1250 pb

-> on ajoutera + 1250 pb à la position de Pst1 dans pGFP recombinant pour avoir la position de HindIII 

=> nouvelle position de HindIII = 2000 + 1250 = 3250 pb