Nanou Posted January 6, 2016 Share Posted January 6, 2016 Bonjour ! J'ai un problème avec l'item B du QCM12 du concours de 2013: "Après maturation des ARNm eucaryotes, il y a un nucléotide supplémentaire sur les ARNm en 5'" Corrigé VRAI. Il semblerait que l'on parle de la coiffe ? Soit la 7-méthyl guanosine. Je pensais que c'était un nucléoside donc, et pas un nucléotide... QCM17: Des chercheurs veulent faire une sonde radiomarquée. Brin codant (fichier joint), la flèche correspond à la coupure de l'endonucléase. Ils utilisent une ADNpolymérase I, des dXTP et une ligase -En utilisant du dATP tritié dans le milieu réactionnel, ils obtiendront une sonde marquée. C'est VRAI. En fait, je ne comprend pas pourquoi ? Il y a un A en 5' donc il est triphosphate. Mais je ne vois pas pourquoi le dATP tritié le remplacerait ? Je pensais que seuls les nucléotides concernés par la synthèse imprégnait ce qu'il y a dans le milieu réactionnel. Ou alors peut être ai-je mal compris l'expérience ? -Pourquoi l'activité 5'-3' exonucléase n'est elle pas nécessaire ? Parce que cela se passe au milieu du brin ? Merci beaucoup ! Link to comment Share on other sites More sharing options...
Jacouille Posted January 6, 2016 Share Posted January 6, 2016 Je suis pas de Maraich mais: coiffe= 7 methyl guanine triphosphate donc c'est bien un nucléotide Les dATP radiomarqués vont s'incorporer a l'ADN lors de la replication Activité 5' 3' exonucléase portée par l'ADN pol I Link to comment Share on other sites More sharing options...
Solution david12 Posted January 6, 2016 Solution Share Posted January 6, 2016 Salut ! Alors : En effet, on considère que la coiffe est un nucléotide. L'incorporation de la coiffe se fait grâce à un GTP qui perdra un Pi, donc on peut considérer que c'est une guanosine diphosphate méthylée liée 5'-5' au phosphate du premier nucléotide de la séquence. L'item parle d'une sonde. pour réaliser un sonde, on procède comme pour une PCR, on réplique la séquence in vitro, avec les enzymes de la réplication. On te donne la brin codant, c'est à dire la séquence que l'on souhaite avoir dans notre sonde. Pour cela, on utilisera un brin matrice, complémentaire (non représenté ici). Comme le brin codant des A, lors de la réplication les enzymes inséreront des A tritiés dans la sonde, cela n'a rien à voir avec la position des A. La position des A aurait été décisive si on avait utilisé des A marqués sur le phosphate comme l'ATP(gamma32). On aurait alors eu une sonde non marquée car le troisième phosphate n'aurait pas été conservé. De plus, un TTP(alphaP32) aurait pu être utilisé, le phosphate alpha étant conservé.Je ne suis pas sûr que ce soit très clair écrit comme ça, n'hésite pas à me dire si tu ne comprend pas. L'activité 5'-3' exonucléase sert surtout à retirer les amorces déjà hybridées sur le brin matrice; or ici, on aura une élimination des nucléotides non marqués présents avant remplacement. Ici, l'activité 3'-5' exonucléase pourra aussi être utile si elle commet des erreurs. Voilà ! N'hésite pas à me dire ce que tu ne comprends pas. Bon courage pour cette dernière ligne droite ! On lâche rien ! Link to comment Share on other sites More sharing options...
Nanou Posted January 6, 2016 Author Share Posted January 6, 2016 Merci beaucoup, ta réponse est très claire !! Donc: la sonde est fabriquée par réplication à partir du brin matrice (par complémentarité), donc on aura une sonde dont la séquence correspond au brin codant donné (même séquence, mais marquée cette fois) ? C'est bien ça ? Est ce que c'est le cas pour toutes les sondes (de faire la réplication à partir du matrice) ? En fait l'endonucléase coupe le double brin et c'est pour ça qu'on a pas besoin de l'activité 5'-3' c'est bien ça? ou elle coupe seulement le codant (auquel cas je n'ai pas compris ^^) ? Link to comment Share on other sites More sharing options...
david12 Posted January 6, 2016 Share Posted January 6, 2016 J'imagine que c'est la même technique pour toutes mes sondes oui, c'est la même séquence exactement mais marquée. Le brin est tout petit et on sépare le brin matrice du brin codant pour permettre la réplication grâce à une étape de dénaturation par la chaleur notamment nous permettant de faire agir la polymerase sur les simples brins créés. Link to comment Share on other sites More sharing options...
Nanou Posted January 7, 2016 Author Share Posted January 7, 2016 D'accord, merci beaucoup !! Link to comment Share on other sites More sharing options...
theclaverie Posted January 7, 2016 Share Posted January 7, 2016 Desole de revenir sur le sujet, mais dans l'énnoncé il est bien dit que les chercheurs utilisent une endonucléase Ce que j'ai compris moi c'est que l'on va couper le brin donné en ennoncé, faire travailler la Pol I avec son activité 5'-3' exonucléase puis avec son activité 5'-3' polymerase mais cette fois ci avec des nucleotides marqués. Du coup je pensais que l'activité exonucléase 3'-5' pouvait être nécéssaire en cas d'erreur. Link to comment Share on other sites More sharing options...
david12 Posted January 7, 2016 Share Posted January 7, 2016 En effet pardon !! Je n'ai pas bien relu l'item ! Honte à moi ! Dans la technique utilisée, il s'agit bien du mécanisme que tu décris tout à fait. Endonucléase et pol 1. J'espère que ma réponse ne vous a pas trop embrouilé. N'hésitez pas sinon ! Bon courage ! Link to comment Share on other sites More sharing options...
theclaverie Posted January 9, 2016 Share Posted January 9, 2016 Et du coup l'activité "proof reading" n'est pas nécessaire quand même? Link to comment Share on other sites More sharing options...
david12 Posted January 9, 2016 Share Posted January 9, 2016 J'imagine que comme c'est dit plus haut, l'activité proof reading sert à la correction des erreurs car une sonde efficace doit être identique à la séquence codant recherchée. Link to comment Share on other sites More sharing options...
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