Questions diverses

[Cantonaise]

Bonjour,

 

Pour la fin du cours de Mme Couderc, j'ai quelque soucis, concernant la PCR

 

1) Pour la RFLP, on fait une PCR classique et après avoir amplifié on met les enzymes de digestion c'est ça ? mais quel resultat atendons nous ?  Car dans l'ADN on peut avoir plein de structures semi palyndromique...

 

2) Pour la cartographie de la DNAse, que se passe-t-il exactement ? On fait une PCR classique, une fois on a eu le bon nb de copies, on va, denaturer et mettre les endonucleases specifiques ? On attend quoi comme resultat ici ? Que cette endonuclease clive la zone mutée ? si on a plusieurs fragments -> mutation sinon, tout va bien ?

 

Merci

[chloem]

Salut

1) Alors la RFLP:
On fait une PCR avant. Puis tu mets une enzyme de restriction. C'est une endonucléase qui coupe l'ADN à un niveau spécifique qui lui est propre, le site de restriction. Et ce site est caractérisé par le fait qu'il est une séquence semi-palindromique. Chaque enzyme a son site de restriction qui lui est propre. Donc on coupe l'ADN.

 

Après pour l'interprétation tout dépend de l'énoncé :

 

a) si l'énoncé dit que: une personne saine présente un site semi palindromique reconnu par l'enzyme de restriction x,

 

alors une mutation a ce niveau ne sera pas reconnu par x.

Donc - il n'y a pas de mutation: action de x : on obtient deux fragments

         - il y a une mutation : pas d'action de x : on a un seul fragment.

 

b ) si l'énoncé dit que la mutation fait apparaitre un site de restriction, c'est le raisonnement inverse :

 

- pas de mutation : pas d'action de y : un seul fragment

- mutation : action de y : deux fragment.

 

2) Pour le deuxième, je te remets la réponse à une question un peu semblable

Alors le principe de la cartographie à la DNAse:

tu fais une amplification PCR puis tu hybrides ton ADN avec une sonde spécifique (qui reconnait une séquence d'intérêt que tu veux étudier) et après tu rajoutes une endonucléase spécifique des simples brins:

et là 2 solutions :

- soit tu n'as pas de mutation sur la séquence d'intérêt et ta sonde s'hybride parfaitement. Tu obtiens donc de l'ADN double brin (la sonde se colle à la séquence). Donc pas de coupure par l'endonuclease : tu n'as qu'un seul fragment par électrophorèse.

- soit tu as une mutation sur cette séquence. La sonde ne peut pas s'hybrider et tu as donc de l'ADN simple brin. Donc action de l'endonucléase : tu obtiens 2 fragments.

Donc c'est une méthode pour détecter une mutation sur une séquence que tu connais.

 

En espérant que ça va t'aider

 

Bon courage !
 

[Cantonaise]

Waouh !! Merci super tutrice

 

Cependant j'ai un petit pb : alors que t'ajoutes une endonucleases specifiques à chaque brin, qu'est ce que ça pourrai changer par rapport à la RFLP ? Car au final la PCR cree des copies identiques, donc je ne vois pas la specificite d'un simple brin... ( je sais, je suis un peu bête )

 

Merci en tout cas

[chloem]

En fait une endonucléase spécifique des simples brins va couper dès que l'ADN est sous forme simple brin. Si l'ADN est sous forme double brin, elle ne peut pas couper.
Donc dans le cas de la cartographie, la sonde, si elle s'hybride, va jouer le rôle du 2eme brin : on aura comme de l'ADN double brin (et empêche l'action de l'endonucléase)

Alors que pour la RFLP, l'endonucléase va couper sur un site très spécifique (le site de restriction).

Mais après, je suis d'accord, le résultat sera équivalent puisque les deux servent à détecter des mutations ponctuelles connues après PCR (c'est la façon de faire qui est différente).

Dis moi si tu n'as toujours pas compris, je suis pas très sure d'avoir été clair...