C 2011 QCM3

[amelomaria]

Bonsoir,

Je bloque au niveau du QCM 3 du concours de 2011.

Je pensais avoir compris la technique de PCR, mais la je ne comprend pas quelle méthode il faut utiliser pour savoir si ce sont les bonnes enzymes pour que le fragment soit bien orienté. De plus je ne comprend la différence entre digestion du produit de PCR et digestion du plasmide ...

Merci d'avance

[Alexx]

Bonsoir

Tout d'abord, ce QCM utilise un fragment résultant d'une PCR mais avoir compris la technique de PCR n'est pas vraiment utile pour la réalisation de ce QCM. Donc si tu avais compris la technique avant de te confronter à cet exercice, ne doute pas de ce que tu avais déjà acquis !

 

Ensuite, pour comprendre ce QCM il faut bien faire la distinction entre Digestion du fragment (produit de PCR) et Digestion du plasmide. En effet le fragment c'est ce que tu veux intégrer dans le plasmide que tu auras ouvert. Je m'explique en répondant aux items :

 

• Item A :

Il s'agit ici de digérer le produit de PCR. Les 2 sites disponibles sur le fragment sont AccI (GT/CGAC) et EcoRI (G/AATTC)
Tu remarqueras que les extrémités produites par les deux enzymes ne sont pas compatibles, ce qui signifie qu'il n'y aura qu'une seule orientation possible quelque soit la (ou les) enzyme(s) qui digéreront le plasmide. L'item est donc correct : en effet cela peut permettre le clonage dans la bonne orientation.

 

• Item B :

On ne regarde toujours que le produit de PCR qui ne possède que les sites AccI et EcoRI. Cependant, l'enzyme Taq (T/CGA) peut reconnaître le site de restriction de AccI (GT/CGAC) puisque tu remarques que AccI contient la séquence de TaqI.

L'item est compté faux mais pour moi il est correct au même titre que le A.

 

• Item C :

Ici on observe la digestion du plasmide !

En premier lieu, il faut vérifier si les enzymes qui sont utilisées pour digérer le plasmide seront compatibles avec les extrémités obtenues sur le fragment quelle que soit l'enzyme utilisée.
On te propose AccI et EcoRI : ça tombe bien, tu as déjà déterminé à l'item A que ces enzymes pouvaient être utilisées sur le fragment.

Maintenant, il faut regarder ce qu'il se passe si tu les utilisent sur le plasmide :

On te dit que le site de clonage multiple possède bien ces deux sites mais que EcoRI est placé AVANT le site de AccI.

Si tu digères par ces deux enzymes, ton fragment s'insérera obligatoirement dans le mauvais sens, l'item est donc faux.

 

• Item D :

Cet item concerne également le plasmide !

On part du principe que le fragment a été digéré soit par AccI _{soit par TaqI} (ce sont les 2 seules possibilités pour le produit de PCR) associé à EcoRI, comme on l'a déterminé à l'item A _{et B}. On obtient donc un fragment qui commence par une extrêmité 5' sortante et qui fini par une extrêmité 5' sortante :

5' CGATXXXXXXXXXXXXXXXG         3'

3'      TAXXXXXXXXXXXXXXXCTTAA 5'

Il faut donc que le plasmide soit digéré par une enzyme compatible (jusqu'ici c'est le même raisonnement qu'à l'item C mais expliqué de manière différente).

On te propose ClaI et EcoRI pour la digestion du plasmide. ClaI étant positionné AVANT EcoRI dans le site de clonage multiple.

 

ClaI et EcoRI te fourniront un plasmide ouvert qui aura la structure suivante :

XXXAT      3'                                5' AATTCXXX

XXXTAGC 5'                                3'          GXXX

 

Tu vois donc que le produit de PCR n'aura pas d'autre choix que de s'insérer dans le bon sens. L'item est donc vrai.

 

• Item E :

La digestion du plasmide par TaqI attaquera toutes les séquences compatibles c'est à dire ClaI (AT/CGAT) et AccI (GT/CGAC).

Mais ce faisant, tu vas éliminer le site de restriction EcoRI du plasmide, tu ne pourras donc pas insérer la deuxième extrémité du fragment.

L'item est donc faux.

 

 

J'espère avoir été clair,

N'hésite surtout pas à demander si tu as besoin d'une autre explication.

Bon courage et bonne nuit

[amelomaria]

Merci bcp pour ton aide  !! C'était super clair, j'ai tout compris 

[Alexx]

Avec plaisir