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Plasmide


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Coucou, je voulais vérifier : quand on nous demande si une enzyme permet de déterminer si le plasmide est bien orienté ou permet de donner la longueur  du plasmide (je sais plus comment on formule ça mais vous avez compris) comment on fait ? 

Ah oui et dans le concours on avait l'amorce 1 et 2 et elle demandait laquelle on devait prendre pour intégrer la cassette là du coup pour savoir il faut tjr prendre une amorce sens et une anti sens et elles doivent etre le plus près du promoteur ou de l'adnc ? 

Ensuite on est bien OK qu'on n'a pas au programme le calcul des pdb ? Le découpage

Pour la phosphorylation comment on sait si c'est possible ou pas ? Que par rapport aux modif post trad ? Ou y a autre chose ? 

@TACKycardie @Amélithium Peut etre que vous pouvez m'aider ? (meme si c'est pas u tout votre domaine mdrr le forum est désert on fait avec les moyens du bord) 

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  • Ancien du Bureau

Salut @Laurie12 !

Alors je préfère te prévenir : ça va faire un moment que j'ai pas revu ces cours ...

Révélation

Vous faites ça en pharma et pas en médecine ?

 

Il y a 5 heures, Laurie12 a dit :

Coucou, je voulais vérifier : quand on nous demande si une enzyme permet de déterminer si le plasmide est bien orienté ou permet de donner la longueur  du plasmide (je sais plus comment on formule ça mais vous avez compris) comment on fait ? 

T'aurais un QCM stp ? comme ça ça sera plus simple ... 😁

 

Il y a 5 heures, Laurie12 a dit :

Ah oui et dans le concours on avait l'amorce 1 et 2 et elle demandait laquelle on devait prendre pour intégrer la cassette là du coup pour savoir il faut tjr prendre une amorce sens et une anti sens et elles doivent etre le plus près du promoteur ou de l'adnc ? 

Qu'est-ce que tu entends par "cassette" ? Tu parles de NeoR et HSV-tk ?

adnc ?! pour ADN complémentaire ? 

 

Il y a 5 heures, Laurie12 a dit :

Ensuite on est bien OK qu'on n'a pas au programme le calcul des pdb ? Le découpage

Aucune idée ... Faut voir avec tes RM de pharma ... Mais moi de mémoire on n'avait pas de vrais calculs, c'était juste quelques trucs à calculer par-ci par-là (mais j'ai eu le Pr Levade, je suis pas sûre que c'est votre cas) ... T'as un exemple ?

 

Il y a 5 heures, Laurie12 a dit :

Pour la phosphorylation comment on sait si c'est possible ou pas ? Que par rapport aux modif post trad ? Ou y a autre chose ? 

La phosphorylation de quoi ? ADN ? ARN ? 

 

Désolée mes cours remontent à loin 😅 Mais si tu as des exemples, ça m'aiderait je pense ...

 

Il y a 5 heures, Laurie12 a dit :

 @Amélithium Peut etre que vous pouvez m'aider ? (meme si c'est pas u tout votre domaine mdrr le forum est désert on fait avec les moyens du bord) 

Je peux toujours essayer mais je pense que tes RM @Squee et @Paul__onium seront beaucoup plus compétents que moi ... ❤

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Salut @Laurie12,

 

Pour l'histoire des enzymes et du sens d'insertion :

Disons qu'on nous propose d'utiliser l'enzyme de restriction Pst1.

Pour déterminer le sens d'insertion il faut 2 conditions :

  • Pst1 doit avoir a minima un site de restriction sur l'insert et un autre sur le vecteur qui accueille cet insert
  • Le site de restriction de Pst1 localisé sur l'insert ne doit pas se situer pile au milieu de l'insert (car sinon on ne pourra pas déterminer le sens d'insertion puisque la taille des fragments obtenus sera la même peu importe que le sens soit correct ou non)

 

Il y a 6 heures, Laurie12 a dit :

Ah oui et dans le concours on avait l'amorce 1 et 2 et elle demandait laquelle on devait prendre pour intégrer la cassette là du coup pour savoir il faut tjr prendre une amorce sens et une anti sens et elles doivent etre le plus près du promoteur ou de l'adnc ? 

Tu aurais le QCM stp ? Pcq une amorce ne permet pas d'intégrer une cassette, simplement d'amplifier un fragment.

 

Il y a 6 heures, Laurie12 a dit :

Ensuite on est bien OK qu'on n'a pas au programme le calcul des pdb ? Le découpage

Pour les pass, jsp ce qu'on vous a dit mais c'est tjs bien de savoir le faire. En paces avec le Pr. Couderc on devait savoir le faire.

 

Il y a 6 heures, Laurie12 a dit :

Pour la phosphorylation comment on sait si c'est possible ou pas ? Que par rapport aux modif post trad ? Ou y a autre chose ? 

Le gros piège ici c'est quand on utilise un organisme procaryote pour produire notre protéine, alors on n'aura pas de modifs post-trad => ça pose pb quand c'est une protéine phosphorylée ou avec des ponts disulfures par exemple.

Si on nous dit que normalement la protéine en question est phosphorylée ou a des ponts disulfures, il faudra un eucaryote pour avoir sa bonne conformation.

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salut @Laurie12, @Amélithium, @OxyGenS

déjà je tiens à dire que je suis vraiment déçue, y a un sujet de plasmide et on m'invite même pas à la fête 😳 ..

bref ceci étant dit

Il y a 7 heures, Laurie12 a dit :

quand on nous demande si une enzyme permet de déterminer si le plasmide est bien orienté ou permet de donner la longueur  du plasmide (je sais plus comment on formule ça mais vous avez compris) comment on fait ?

il faut que ton enzyme permette de couper le plasmide en plusieurs fragment de tailles différentes selon le sens d'insertion du fragment (je t'invite à aller voir les autres posts que j'ai fait là dessus) 

 

 

 

 

 

Il y a 7 heures, Laurie12 a dit :

Ensuite on est bien OK qu'on n'a pas au programme le calcul des pdb ? Le découpage

c'est AU PROGRAMME !!!! va voir les posts que j'ai fait aussi 

 

Il y a 7 heures, Laurie12 a dit :

Pour la phosphorylation comment on sait si c'est possible ou pas ? Que par rapport aux modif post trad ? Ou y a autre chose ? 

ce qu'il faut absolument que tu retiennes

si on produit dans un organisme sachant qu'on aura 

-  pas de modifications post traductionnelles car transcription et traduction simultanées (cf les cours de Couderc en génome au S1) => choisir un promoteur procaryote (ou eucaryote mais on ne le choisit pas car ça coute plus cher que les promoteurs procaryotes et ça donnerait le même résultat à l'arrivée donc on privilégie plutôt les procaryotes mais techniquement c'est possible)

-  des modifications post traductionnelles possibles car transcription et traduction NON simultanées mais se succèdent (cf les cours de génome de Couderc du S1 également)=> choisir un promoteur eucaryote 

 

(je suis en train de chercher mes autres posts la dessus pour te les insérer ici)

edit : j'ai regardé les autres posts et ça dérive un peu des questions que tu as posées donc a priori ça devait déja être clair pour toi (toute l'histoire de clonage orienté ou non orienté, de transfection etc => si c'est pas le cas dis moi et je te mettrai les liens des posts)

 

 

bon courage pour ces révisions 

Edited by cassolnousmanque
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  • Ancien du Bureau

@cassolnousmanque j'allais le faire justement quand j'ai vu ta signature sur le post des LAS sauf que mon ordi s'est éteint pcq j'avais plus de batterie ... 😂 Ne nous en veut pas stp ... 😥

 

Du coup je confirme, j'ai pas eu les mêmes cours que vous donc y'a des notions de votre programme que j'ai pas vu ...

En tout cas merci à vous deux @OxyGenS et @cassolnousmanque vous gérez ! ❤ 

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OK alors j'ai vu les post et vos réponses il me reste juste à comprendre comment on détermine si un plasmide peut déterminer la bonne insertion du fragment. J'arrive pas à insérer des qcm mais en gros hier j'ai fait une annale de 2020 c'était purpan (ou marraicher dsl) et y avait cette question. Ensuite pour l'orientation j'ai compris. Phosphorylation oui du coup comment on fait si on veut transformer une bactérie mais qu'on a besoin d'une phosphorylation pour activer l'adnc ? 

Et aussi si on a 2 plasmdes différents on choisi celui avec les enzymes présentes sur notre fragment d'adnc et qui se trouve après le bon promoteur c'est tout ? 

Et pour choisir les bonnes eznymes on prend celle qui se situe avant le bon promoteur et l'adnc et une qui est après le terminateur ? Juste ça ? 

@cassolnousmanque

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salut @Laurie12, désolé de répondre 2 jours après, j'avais 2 jours de boulot intenses au vaccinodrome donc je n'étais absolument pas capable de réponde sur le forum haha 

maintenant je suis de retour 🙂 

 

on va faire question par question 

Le 19/05/2021 à 08:18, Laurie12 a dit :

comment on détermine si un plasmide peut déterminer la bonne insertion du fragment.

je suis pas sure d'avoir bien compris ta question, je te réexplique un peu (si jamais ce n'était pas ta question n'hésite pas à me la reposer) 

tu vas insérer ton fragment dans le plasmide en fonction des enzymes de restriction que tu vas utiliser

- premier cas: tu utilises 2 enzymes différentes : le fragment ne peut s'insérer que dans 1 seul sens, donc s'il s'insère, tu déduis directement son sens 

- deuxième cas : tu utilises 2 enzymes identiques : le fragment peut se mettre soit dans un sens, soit dans l'autre. Pour savoir s'il est inséré dans le bon sens (= celui qui va permettre de faire la transcription et traduction si nécessaire) tu vas utiliser la place des enzymes sur le fragment.

 

exemple: si je dessine le fragment de 300 pb 

--------------------------------------------------

    /                     /                                   /                /                   (coupures) 

    A                   B                                 C                D                   (nom des enzymes)

    20                 60                               210          300               (nombre de paires de bases)

 

ici tu vois que si je coupe par A et par C : j'aurai un fragment de 210 - 20 = 190 pb 

 

maintenant admettons qu'on ai plutôt ce fragment là :

 

--------------------------------------------------

    /                     /                                   /                /                   (coupures) 

    A1                   B                                A2             D                   (nom des enzymes)

    20                 60                              210         300               (nombre de paires de bases)

 

Si on coupe uniquement par A : on aura un fragment de 190 pb (comme au dessus vu que 210-20 = 190 ça n'a pas changé :)) sauf que là on ne sait pas s'il est dans ce sens -> ou bien dans celui là <- 

donc on va utiliser la place de l'enzyme B sur le fragment : B est à 40 pb de A1 (60-20 =40) et B est à 150 pb de A2 (210 - 60 = 150)

=> en fonction du sens d'insertion, on verra où se trouve l'enzyme B par rapport au plasmide 

 

est ce que tu comprends ? 

 

 

Edited by cassolnousmanque
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Le 19/05/2021 à 08:18, Laurie12 a dit :

Phosphorylation oui du coup comment on fait si on veut transformer une bactérie mais qu'on a besoin d'une phosphorylation pour activer l'adnc ? 

si tu prends un gene que tu veux insérer dans une bactérie il te faut un promoteur procaryote donc forcément, il n'y aura pas de phosphorylation de l'adnc (pour les raisons que je t'ai expliquées juste au dessus dans les réponses précédentes )

 

la phosphorylation fait partie des modifications post traductionnelles donc automatiquement c'est rattaché à un organisme eucaryote 

Le 19/05/2021 à 08:18, Laurie12 a dit :

Et aussi si on a 2 plasmdes différents on choisi celui avec les enzymes présentes sur notre fragment d'adnc et qui se trouve après le bon promoteur c'est tout ? 

si on te demande de choisir le plasmide qu'il faut utiliser, tu regardes dans le fragment que tu veux insérer à quel endroit se trouvent les enzymes et tu choisis celles qui encadrent le promoteur et le terminateur pour permettre la traduction et la transcription au sein du plasmide une fois le fragment inséré 

 

si jamais on te dit de couper avec des enzymes dont une qui coupe le fragment APRES le promoteur ou AVANT le terminateur => tu auras surement une question qui te demandera si la traduction est possible => réponse NON vu qu'il manque des éléments essentiels pour la traduction (promoteur ou/et terminateur) 

Le 19/05/2021 à 08:18, Laurie12 a dit :

Et pour choisir les bonnes eznymes on prend celle qui se situe avant le bon promoteur et l'adnc et une qui est après le terminateur ? Juste ça ? 

 

oui exactement 

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@cassolnousmanque Ah merci beaucoup !! C'est plus clair !

Juste pour connaitre le sens avec l'enzyme qui coupe il faut en utiliser une au milieu donc mais elle doit se trouver au milieu du plasmide entier ou au milieu entre promoteur et terminateur ? 

PS : j'ai toujours cru que t'étais en pass je viens de faire une découverte là 😱

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salut @Laurie12

je remets le message, je crois que sans faire exprès je l'avais publié en masqué et j'arrive pas à le remettre en visible

 

Il y a 14 heures, Laurie12 a dit :

Juste pour connaitre le sens avec l'enzyme qui coupe il faut en utiliser une au milieu donc mais elle doit se trouver au milieu du plasmide entier ou au milieu entre promoteur et terminateur ? 

il faut que l'enzyme ne soit pas au milieu (= soit avant, soit après mais pas pile au milieu) entre les deux enzymes qui coupent dans le plasmide sinon on ne pourra rien déduire du tout 

 

si je reprends l'exemple avec les couleurs 

 

--------------------------------------------------

    /                     /                                   /                /                   (coupures) 

    A1                   B                                A2             D                   (nom des enzymes)

    20                 60                              210         300               (nombre de paires de bases)

 

ici, on coupe avec A 

B est à 40 pb de A1 et à 150 pb de A2 (comme je t'ai expliqué au dessus) 

donc quand on l'insérer dans le plasmide, tu regardes par rapport au sens de traduction (donc dans l'ordre : promoteur puis adnc puis terminateur) et tu vois combien de pb séparent A et B (vu qu'a priori comme tu cherches le sens, tu sais pas si c'est A1 ou A2) 

 

PAR CONTRE : si on avait ça 

 

 

--------------------------------------------------

    /                      /                                   /                /                   (coupures) 

    A1                   B                                A2             D                   (nom des enzymes)

    0                 100                              200         300                  (nombre de paires de bases)

 

ici B est à 100 pb de A1 (100-0=100) et à 100 pb de A2 (200-100=100)

donc il est aussi loin de A1 que de A2 => peut importe le sens d'insertion, on ne pourra pas le déterminer avec l'enzyme B 

 

tu vois un peu le concept ? 

 

Il y a 14 heures, Laurie12 a dit :

PS : j'ai toujours cru que t'étais en pass je viens de faire une découverte là 😱

je suis bien en PASS 😹, t'as découvert quoi ?

Edited by cassolnousmanque
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  • Solution
Le 23/05/2021 à 07:55, Laurie12 a dit :

@cassolnousmanque OK j'ai compris si ton plasmide fait 100 pdb l'enzyme doit etre par ex à 30 mais surtout pas  à 50 

Ah je croyais que t'étais en paces finalement je me suis trompée mdrr

exact 😉

si c'est ok pour toi pense à passer le sujet en résolu 

bon courage 🤝

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