Colle 5 M2020

[OxyGenS]

Bonjour !

Dsl pour ce long sujet

 

QCM 2 CDE :

Révélation

 

1) Concernant le C (vrai), je l'ai interprété comme si on clivait soit juste avant (soit juste après, peu importe) le 1er TGA de telle sorte que l'étiquette ne soit plus liée au début de la protéine. Or je me suis trompée, il fallait comprendre qu'on enlevait seulement le 1er codon stop.

--> il n'y aura jamais de piège sur soit on enlève que le TGA soit on clive TGA+ce qu'il y a après ?

 

QCM 4 ADE :

Révélation

 

2) Concernant le C (faux), correction : "elle correspond à la charge de l'extrait sur la colonne" 

J'ai noté que la charge c'était juste avant la première augmentation de l'absorbance, que l'élution c'était au niv du pic à droite. Et j'ai cru comprendre en écoutant le cours que le lavage était justement le plateau.

A quel moment est le lavage du coup ? C'est la diminution de l'absorbance juste après le plateau ?

 

3) Pour le E (vrai), qqun pourrait faire un récap de la façon d'éluer selon les chromato ?

 

QCM 7 AD :

Révélation

4) Item C (faux), correction : "le clonage étant non orienté, on pourra obtenir 3 vecteurs différents : l’un ayant intégré l'ADNc dans le bon sens, l’autre l’ayant intégré dans le mauvais sens, et le dernier ne l’ayant pas intégré et s’étant refermé sur lui-même".

Puisqu'on peut obtenir 3 plasmides différents alors il est possible d'en obtenir 2 différents non ?

Bettina fait des pièges comme ça ?

 

5) Item E (faux), je suis d'accord avec ça. Correction : "si on fait une digestion par BamH1, on ne fera que re séparer le plasmide et l’insert, donc grâce à la taille et le nombre de fragments on pourra savoir si le vecteur a intégré l’ADNc ou s’il s’est refermé sur lui-même, mais on ne pourra pas déterminer avec cette enzyme là si l’insert s’est mit dans le bon sens ou non. . Pour savoir si le sens est bon, il faudra par exemple faire une digestion par HindIII et faire migrer les fragments sur un gel d’agarose"

Je sais que ce n'est pas nécessaire pour répondre à l'item mais j'aimerais savoir si je trouve les bonnes tailles de fragments quand on digère avec HindIII.

Je trouve que le plasmide contenant l'insert fait 6,48kb.

Si insert dans le bon sens on a :                            Si insert dans le mauvais sens :

- 2,65kb                                                                       - 2,34kb

- 2,34kb                                                                       - 2,30kb

- 1,49kb                                                                       - 1,84kb

 

 

6) QCM 8 ABD : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/05/b7p5.png

Item B (vrai) : en transgenèse additive on ne fait jamais de sélection avant transfection ?

On vérifie seulement une fois la transfection réalisée quels animaux sont transgéniques ?

 

Merci

[PierrickSenior]

Bonjour @OxyGenS, 

 

il y a une heure, OxyGenS a dit :

1) Concernant le C (vrai), je l'ai interprété comme si on clivait soit juste avant (soit juste après, peu importe) le 1er TGA de telle sorte que l'étiquette ne soit plus liée au début de la protéine. Or je me suis trompée, il fallait comprendre qu'on enlevait seulement le 1er codon stop.

--> il n'y aura jamais de piège sur soit on enlève que le TGA soit on clive TGA+ce qu'il y a après ?

Je pense que l'item n'est pas des plus clair et le jour j, il n'y aura pas d'ambiguïté bien sur. 

 

il y a une heure, OxyGenS a dit :

 

2) Concernant le C (faux), correction : "elle correspond à la charge de l'extrait sur la colonne" 

J'ai noté que la charge c'était juste avant la première augmentation de l'absorbance, que l'élution c'était au niv du pic à droite. Et j'ai cru comprendre en écoutant le cours que le lavage était justement le plateau.

A quel moment est le lavage du coup ? C'est la diminution de l'absorbance juste après le plateau ?

 

3) Pour le E (vrai), qqun pourrait faire un récap de la façon d'éluer selon les chromato ?

Alors selon les définitions du cours la charge est le fait de déposer l'extrait brut et le lavage le fait d'intégrer une solution de lavage pour extraire les protéines/éléments non retenus sur la colonne. Donc finalement le phénomène de lavage est de garder seulement la protéine a éluer. Donc la plateau correspond bien au lavage d'une partie de la charge. Par conséquent j'aurai tendance à dire comme toi pour cet item ! 

 

Les façons d'éluder sont différentes pour chaque chromatographies attention : 

  Pour l'échangeuse ion on peut éluer grâce à une modification du pH de la solution, ce qui aura pour effet de modifier la charge présentée par la protéine. Ou alors une augmentation des forces ioniques (NaCl), le sel va, par phénomène de compétition va se lier aux billes à la place de la protéine à éluer. 

  Pour la gel filtration il n'y a pas vraiment d'éluer, c'est simplement la vitesse de passage dans la colonne qui sera différente en fonction des protéines et de leurs poids moléculaire. 

  Pour la chromatographie d'affinité soit modif du pH ou des forces ioniques (augmentation ou diminution on s'en fout) pour modifier l'intéractions faibles, soit compétition avec un élément qui à de l'affinité pour la colonne ou pour la protéine à éluer. 

   Pour la chromatographie hydrophobe on va diminuer les forces ioniques ce qui a pour effet de diminuer les interactions hydrophobes. 

 

il y a une heure, OxyGenS a dit :

4) Item C (faux), correction : "le clonage étant non orienté, on pourra obtenir 3 vecteurs différents : l’un ayant intégré l'ADNc dans le bon sens, l’autre l’ayant intégré dans le mauvais sens, et le dernier ne l’ayant pas intégré et s’étant refermé sur lui-même".

Puisqu'on peut obtenir 3 plasmides différents alors il est possible d'en obtenir 2 différents non ?

Bettina fait des pièges comme ça ?

Encore une fois ça sera sans doute tourné différemment mais c'est bien 3 vecteurs qui seront obtenus, le chiffre 2 ici faisait office de piège. 

 

il y a une heure, OxyGenS a dit :

6) QCM 8 ABD : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/05/b7p5.png

Item B (vrai) : en transgenèse additive on ne fait jamais de sélection avant transfection ?

On vérifie seulement une fois la transfection réalisée quels animaux sont transgéniques ?

Exactement, dans l'exemple du cours on faut une biopsie de la queue puis une analyse PCR pour voir quelles souris ont intégré le gène mais contrairement à la transgénèse par recombinaison homologue il n'y a pas de sélection par antibiotiques. 

 

 

Bonne journée à toi. 

[MOoodLeEEee]

(re)Salut :))

Alors, on va diviser en plusieurs parties, ça sera plus simple.

 

1) La C est bien vraie, car une fois que tu coupes ton codon stop, tu vas avoir la partie de la protéine qui est en N-term de celui-ci, qui va être élue, donc ne plus être retenue dans ta colonne. La partie C-terminal par contre, va rester attachée du fait de l'étiquette 6-His. Néanmoins, si on rajoute de l'imidazole, qui a une affinité supérieure à celle de ton Histidine pour la colonne à édition, et bien par compétition, ton étiquette va se détacher. Ainsi, c'est bien l'imidazole qui a permis cette élution ! 

 

Pour le reste, je n'étais pas Maraîchois donc je pense pas pouvoir t'éclaircir..

 

PS : @PierrickSenior, j'avais commencé à écrire ça avant que tu répondes et j'étais en train de chercher des info :))

 

 

 

Edited February 3, 2021 by MOoodLeEEee

[OxyGenS]

Merci bcp @PierrickSenior @MOoodLeEEee

[OxyGenS]

Il y a 6 heures, OxyGenS a dit :

5) Item E (faux), je suis d'accord avec ça. Correction : "si on fait une digestion par BamH1, on ne fera que re séparer le plasmide et l’insert, donc grâce à la taille et le nombre de fragments on pourra savoir si le vecteur a intégré l’ADNc ou s’il s’est refermé sur lui-même, mais on ne pourra pas déterminer avec cette enzyme là si l’insert s’est mit dans le bon sens ou non. . Pour savoir si le sens est bon, il faudra par exemple faire une digestion par HindIII et faire migrer les fragments sur un gel d’agarose"

Je sais que ce n'est pas nécessaire pour répondre à l'item mais j'aimerais savoir si je trouve les bonnes tailles de fragments quand on digère avec HindIII.

Je trouve que le plasmide contenant l'insert fait 6,48kb.

Si insert dans le bon sens on a :                            Si insert dans le mauvais sens :

- 2,65kb                                                                       - 2,34kb

- 2,34kb                                                                       - 2,30kb

- 1,49kb                                                                       - 1,84kb

 

J'ai clôturé le sujet sans remarquer que cette question était restée sans réponse dsl.

Si qqun a pas la flemme de calculer j'aimerais bien savoir si j'ai bon sur la taille des fragments, merci !

[Hypnos]

20 hours ago, OxyGenS said:

5) Item E (faux), je suis d'accord avec ça. Correction : "si on fait une digestion par BamH1, on ne fera que re séparer le plasmide et l’insert, donc grâce à la taille et le nombre de fragments on pourra savoir si le vecteur a intégré l’ADNc ou s’il s’est refermé sur lui-même, mais on ne pourra pas déterminer avec cette enzyme là si l’insert s’est mit dans le bon sens ou non. . Pour savoir si le sens est bon, il faudra par exemple faire une digestion par HindIII et faire migrer les fragments sur un gel d’agarose"

Je sais que ce n'est pas nécessaire pour répondre à l'item mais j'aimerais savoir si je trouve les bonnes tailles de fragments quand on digère avec HindIII.

Je trouve que le plasmide contenant l'insert fait 6,48kb.

Si insert dans le bon sens on a :                            Si insert dans le mauvais sens :

- 2,65kb                                                                       - 2,34kb

- 2,34kb                                                                       - 2,30kb

- 1,49kb                                                                       - 1,84kb

Salut

je te confirme que ce sont les bonnes valeurs, et c’est bien de t’entraîner à apprendre à identifier quelles enzymes permettent de vérifier l’orientation !

[OxyGenS]

il y a 1 minute, Hypnos a dit :

Salut

je te confirme que ce sont les bonnes valeurs, et c’est bien de t’entraîner à apprendre à identifier quelles enzymes permettent de vérifier l’orientation !

 

Merci