annale 2019

[Herlock]

Bonjour,

 

En faisant ce QCM, j'ai buté sur ce qu'était la digestion (soit du produit PCR soit du plasmide) en regardant sur le forum, je n'ai toujours pas compris le principe mais aussi sur le site de clonage, comment ça marche avec les enzymes de restriction ?

On n'a pas vraiment vu ce principe en cours, du coup est ce que ce serait possible que vous l'expliquiez une nouvelle fois ?

 

Merci.

 

Voici l'énoncé du qcm : 

 

https://image.noelshack.com/fichiers/2020/45/5/1604655814-annale2019.png

 

https://image.noelshack.com/fichiers/2020/45/5/1604655814-annale2019suite.png

[Emmastoïde]

Salut ! 

 

Alors les enzymes restrictions sont des enzymes qui sont capable de couper la liaison phosphodiester entre deux nucléotides. 

On peut donc "digérer"=coupe un fragment d'ADN par des enzymes de restriction. 

Pour un plasmide, on peut par exemple l'ouvrir en le coupant 1 fois par une enzyme de restriction -> il ne sera plus circulaire comme ouvert. 

 

En clonage, les enzymes de restrictions sont utilisées pour insérer une cassette d'expression dans un modèle permettant sa reproduction. 

Si par exemple on étudie un gène responsable d'une mutation d'une protéine X présente dans les oreilles de souris, on peut "implanter" à la souris un plasmide auquel on aura rajouté un gène de fluorescence qui va permettre de rendre fluorescente la protéine d'intérêt.

On va donc réaliser un plasmide, avec une origine de réplication (ORI), et le gène permettant l'expression de la protéine X en question (précédé d'un promoteur et suivit d'un terminateur), comme c'est construit avec le gène de la lucéférase dans l'énoncé. 

 

Si par exemple nous voulons mettre un gène codant la GFP (protéine fluorescente) avant la séquence codant la protéine X, on peut insérer dans le plasmide une casquette d'expression (promoteur-ARNm-terminateur) permettant l'expression de la GFP. 

Pour insérer cette cassette, il va falloir ouvrir le plasmide. 

On va ouvrir le plasmide en le digérant avec des enzymes de restriction. 

 

Les enzymes de restriction coupent chacune à un site (suite de nucléotide) précis. 

Pour que la complémentarité soit bonne entre la cassette à insérer et le plasmide, il faut utiliser la même enzyme de restriction qui ouvre le plasmide, et qui coupe la cassette à insérer. 

Je te l'ai représenté sur ce schéma

:

 

Pour aller plus loin dans la compréhension, (mais si vous n'avez pas du tout approfondi la technique en cours ne te prend pas la tête, c'est juste pour comprendre):

Idéalement, il faut être sûr que la cassette va s'insérer dans le bon sens, c'est à dire Promoteur -> ARNm -> Terminateur (et pas à l'envers), il est judicieux d'utiliser 2 enzymes de restriction différentes pour digérer le plasmide, une qui coupe au début de la cassette d'expression (et située en premier sur le plasmide) et une deuxième située à la fin de la cassette d'expression (et situé après la 1e sur le plasmide, pour ne pas croiser). 

Je te fais un autre schéma pour imager : 

 

 

Donc ici, pour orienter ta cassette dans le bon sens, on peut utiliser EcoR1 et BamH1 car ils sont situés de manière idéale pour l'insertion. 

 

Sur le plasmide, les différents sites de coupure des enzymes sont généralement regroupé dans un MCS (Site Multiple de Clonage), tu peux le voir sur le schéma de ton énoncé. 

Donc imagine que EcoR1 et BamH1 de mon schéma soient dans le MCS (que je n'ai pas représenté pour alléger le schéma)

 

Tout ce que je viens de t'expliquer va plus dans le matière "recherche", et je crois que vous ne la traitez plus à part, donc si tout ça n'a pas été vu en cours cette année, pas besoin de se prendre la tête avec. 

 

J'espère avoir pu t'éclaircir un peu sur le sujet !

 

Bon courage !

 

[Herlock]

Merci @Emmastoïde, c'est super clair !!!!!! 

Les schémas complémentaires sont top pour la compréhension merci!

Edited November 6, 2020 by Herlock

[Emmastoïde]

Avec plaisir !! Ravie d'avoir pu t'aider 

[Herlock]

Est ce que je peux me permettre de poser des questions sur le qcm ici ou sur un nouveau post  parce que je ne comprends pas pourquoi certains items sont vrais!