AnneClaireT Posted January 7, 2015 Share Posted January 7, 2015 Bonjour, Voici quelques questions de génome qui me posent soucis (j'ai verifié au préalable si elles aveient été posées sur tutoweb ) Le concours 2013 qcm 10-B... Je ne comprend pas pourquoi ça ne pourrait pas être semblable à un récepteur nucléaire vu les structures en doigts de zinc. Pour après deux petites questions sur les protéines de fusion, en fait souvent on nous pose des questions avec la composition d'une protéine de fusion et je n'y arrive pas vraiment, savoir ce qui est en N terminale ou non (par exemple sur le qcm 10 item C ci joint). Puis la dernière le qcm 11 item A compté faux, pour moi dans le cours c'est bien avec le glutathion. Merci Génome.pdf Link to comment Share on other sites More sharing options...
Solution ninou Posted January 10, 2015 Solution Share Posted January 10, 2015 Salut ! -Alors pour le cc2013 10B, il y a pas plus d'explication que ça, c'est faux pour plusieurs raison, par absence de domaine de liaison au ligand, et de façon générale par absence des 5/6 domaines qu'on trouve pour les récepteurs nucléaires, car tu veras au deuxième quad que chacun des domaines à une fonction importante dans le fonctionnement de celui-ci. -pour les protéines de fusion classique tu as dans l'ordre de N vers C: l'étiquette (tag) : la glutathion S transferase, correspond à une enzyme ayant une affinité pour le glutathion ( attention, c'est différent du glutathion qui lui n'est pas dans la protéine de fusion ) le site de la TEV protéase la protéine d'interêt Voilà comment marche une protéine de fusion: on intègre les plasmide contenant la séquence correspondant à la protéine que l'on vient de décrire dans les bactéries. Celles-ci vont produire entre autre la protéine que l'on vient de décrire. A partir de là, on souhaite purifier la protéine. C'est a dire que l'on souhaite l'obtenir sous forme pure, séparée de son etiquette. On va tout d'abord extraire nos protéine de fusion des autres protéines produites par la bactérie.Pour cela, on fait appelle au tag : en effet la GST ayant une affinité pour le glutathion, on utilise des billes magnétiques couplées au glutathion, afin que celles-ci ne retiennent que les protéines contenant le tag. Par la suite on lave les billes magnétique par du glutathion en excès, qui va prendre la place de celui couplée au billes, ce qui va permettre de découpler nos protéines de fusion des billes. On souhaite maintenant éliminer l'étiquette. Pour cela, on place nos protéines de fusions dans un milieu dans lequel on introduit de la TEV protéase, qui va les couper au niveau de son site de clivage, correspondant justement à la jonction entre le tag et la protéine d'intérêt. Nous avons alors dans ce milieu : nos protéines, les tag et la tev protéase. On extrait les tag du milieu en utilisant à nouveau des billes magnétiques couplées au glutathion, et on extrait la tev protéase par des billes magnétique couplées à du Nickel ( on sait que cette protéase a une affinité pour le nickel ). Nous avons alors nos protéines purifiés - Pour les protéine de fusion à expression inductible: au niveau de la sequence on a de 5' vers 3' le promoteur/opérateur du gène lac z le gène lac z site multiple de clonage : lieu d'introduction de la protéine d'intérêt, se situant DANS le gène lac Z au niveau de la protéine non recombinante on aura donc de N vers C le gène lac zau niveau de la protéine recombinante, c'est à dire correspondant à un plasmide où un fragment d'ADN a été intégré dans le SMC le début du gène lac z la protéine d'intérêt Cette structure de la protéine de fusion à deux objectifs. Le premier est d'avoir une expression inductible: on rappelle que la transcription du gène lac Z se fait en présence de lactose, qui levera l'inhibition du P/O du gène lac z en fixant la protéine répresseur produite par lac i, on pourra donc choisir le moment où la protéine sera exprimée en administrant de l' IPTG qui va fixer le répresseur et empêcher le blocage de la transcription du gène lac z. La deuxième est de permettre la selection des bactéries recombinantes. En effet si il y a eu recombinaison, c'est à dire: intégration du fragment d'ADN dans le SMC, le gène lac z sera "tronqué". On trouvera en 5' le début de celui-ci, puis on trouvera la séquence de notre fragment d'ADN. Le gène lac z sera donc incomplet et ne permettra pas de produire la beta galactosidase en entier: la fonction de cette enzyme ne sera donc pas assurée. On rappel que le gène lac z est responsable de la production de la beta galactosidase, qui hydrolyse le lactose. Ainsi la beta gal sera donc exprimés seulement chez les bactéries NON RECOMBIANTE. Afin de pouvoir sélectionner las bactéries recombinantes, nous allons introduire du XGAL, un analogue du lactose qui lorsqu'il est hydrolyser par la beta gal, donnera un composé qui colorera la bactérie en bleu. Ainsi, si après administration de Xgal, la colonie bactérienne se colore en bleu, cela signifie que celle-ci à produite une beta gal fonctionnelle, et donc qu'elle correspond à des bactéries non recombinantes. L'absence coloration bleu permettra donc une sélection des bactéries recombinante. Voilà pour les explications, c 'est long et laborieux, mais je suis permise de tout réexpliquer car il est plus facile de comprendre la structures des protéines de fusions lorsqu'on sait à quoi elles servent. J'espère sincèrement que j'ai été claire et que tu as bien compris, parce que c'est pas évident à expliquer Dans tous les cas, bon courage Link to comment Share on other sites More sharing options...
AnneClaireT Posted January 10, 2015 Author Share Posted January 10, 2015 Merci, merci, merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci,merci... Je ne le dirai jamais assez! Tout est très clair, tu m'as enlevé pleins de doutes et d'incertitudes! Merci beaucoup Ninou Link to comment Share on other sites More sharing options...
ninou Posted January 10, 2015 Share Posted January 10, 2015 Avec plaisirs !!!!!! Link to comment Share on other sites More sharing options...
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