Immunoprécipitation/ Co immunauprécipitation

[V16]

Bonjour, 

je suis en train de relire mes cours et je me rend compte que c'est pas hyper clair pour moi l'exemple donné dans les diapos sur le Rc a activité tyrosine kinase. (diapos 20 =>24)
Est ce que qqn pourrait m'éclairer cette partie...

Merci beuacoup

Edited June 1, 2020 by V16

[Mathou09]

Salut ! 

La première diapo est juste là pour aider à comprendre l'exemple, en gros que les récepteurs tyrosine kinase vont recruter la PI3K pour faire leur activité. 

 

Ensuite, sur la deuxième diapo il explique le fonctionnement de l'immuno-précipitation. Dans l'exemple, on veut immuno-précipiter le PDGF-R qui est un récepteur à activité tyrosine kinase. Donc pour ça, on incube des fibroblastes (parce qu'ils sont facilement cultivables) puis on va les lyser pour avoir accès à ce qui se trouve dans la cellule. Après on utilise un anticorps anti-PDGF-R, qui va donc se lier au récepteur qu'on veut voir, et on va aussi rajouter de la protéine A qui va se lier au fragment Fc de l'anticorps, ainsi qu'une bille de sépharose pour pouvoir faire sedimenter le tout au fond du tube. On pourra ensuite mettre ces éléments dans un milieu SDS pour ensuite faire une électrophorèse qu'on voit dans la 4ème diapo. 

 

Sur la troisième diapo, il explique donc la co-immunoprécipitation qui est basée sur les mêmes principes que l'immuno-précipitation. La différence ici est qu'on a fait en sorte que le PDGF-R soit activé, on a donc incubé des fibroblastes et du PDGF qui va donc activé le récepteur et engendrer la cascade de signalisation en recrutant toutes les protéines associées à cette cascade. Dans l'exemple le PDGF va permettre la phosphorylation des tyrosines intracellulaires du récepteur, qui vont elles mêmes permettre la liaison de la PI3K et donc son activité. On va ensuite lyser les cellules pour récupérer ce qu'il y a dedans puis mettre un Ac anti-PDGF-R qui va donc toujours se lier au PDGF-R, mais ici, comme le récepteur à été activé, il est aussi lié à la PI3K. Ensuite comme dans l'autre diapo on met de la protéine A, des billes de sepharose qui vont permettre de faire sédimenter le récepteur et ce qui y est accroché puis on les mets dans un milieu SDS pour faire une électrophorèse. 

 

Puis la dernière diapo où on a les résultats de nos expériences. L'electrophorese a été faite et le western blot va nous permettre de voir les résultats. Sur la partie gauche on fait un western blot avec un Ac anti-PDGF-R sur les deux expériences (avec et sans PDGF), dans les deux cas on voit bien qu'il y a le récepteur au PDGF. Sur la partir droite on utilise un Ac anti-PI3K pour le western blot, toujours sur les deux expériences : sans PDGF on ne voit rien ce qui est normal vu que le récepteur n'est pas actif, il n'est donc pas lié à cette protéine, l'immuno-précipitation n'a donc pas pu l'amener jusqu'ici; avec PDGF on voit bien qu'il y a la PI3K. Donc en qcm sans les infos qu'on te donne au début tu pourrais en déduire que le PDGF-R interagit avec la PI3K lors de sa signalisation cellulaire.

Ce qui est important c'est de ne pas confondre les Ac utilisés pour l'immunoprecipité (ici toujours l'anti-PDGF-R) et ceux utilisés pour le western blot (ici soit l'anti-PDGF-R ou L'anti-PI3K). 

 

Voilà voilà c'est un peu long désolé c'est l'explication générale mais si tu veux que je revienne sur certains détails n'hésite pas ! 

[V16]

D’accord merci c’est bon !