trangénèse/ ADN recombiant vrac

[Ju_geote]

salut j'ai pas mal de questions… si quelq'un sait pour quelques unes… : 

 

-      -     Est-ce qu’un vecteur peut déjà avoir un promoteur eucaryote ou il faut forcement le rajouté lorsque l’on fait de l’ADN recombinant ? idem, Est-ce que le gène codant pour l’ampicilline est déjà dans le plasmide ou là aussi il faut l’ajouté pour sélectionner après les bactéries résistantes ?

 

-        -   Lorsque l’on fait une recombinaison homologue sur zygote (a cause de la présence d’une mutation par exemple), un seul chromosome est touché par la recombinaison, donc l’autre chromosome, qui a encore la mutation, ne peut avoir quand même des effets négatifs liées a la mutation ? même si un des deux chromosomes est « réparé »

 

-         -   Dans le cours de bettina, lors d’une recombinaison homologue pour générer un individus KO pour une gène donné, il faut attendre plusieurs génération c’est ca ? parce que les individus « chimère » sont tout au plus hétérozygotes donc pas totalement KO… ou si ? (a moins que le chromosome transgénique soit dominant par rapport au sauvage ?)

Dans le même style (ouais c’est sûr il y a un truc que je comprends pas) : « Pour obtenir un animal KO pour un gène donné, on va remplacer le gène en question par une cassette d'expression codant pour un gène inerte, on a donc éliminé le gène d'intérêt. » compté vrai mais il reste quand même sur l’autre chromosome non touché non ?

merciiii d'avance !! 

[windu]

Salut !

Le 29/05/2020 à 19:39, miss_tinguette a dit :

Est-ce qu’un vecteur peut déjà avoir un promoteur eucaryote ou il faut forcement le rajouté lorsque l’on fait de l’ADN recombinant ? idem, Est-ce que le gène codant pour l’ampicilline est déjà dans le plasmide ou là aussi il faut l’ajouté pour sélectionner après les bactéries résistantes ?

Dans les deux cas, il me semble qu'il (le promoteur ou le gène de résistance) peut se trouver déjà dans le vecteur/plasmide ou on peut le rajouter selon les cas. 

 

Le 29/05/2020 à 19:39, miss_tinguette a dit :

Lorsque l’on fait une recombinaison homologue sur zygote (a cause de la présence d’une mutation par exemple), un seul chromosome est touché par la recombinaison, donc l’autre chromosome, qui a encore la mutation, ne peut avoir quand même des effets négatifs liées a la mutation ? même si un des deux chromosomes est « réparé »

Je ne suis pas certain de comprendre le cas que tu veux aborder mais je vais essayer d'apporter des éléments, n'hésite pas à me dire si tu ne parlais pas du tout de ça  

La recombinaison homologue déjà par principe touche les deux chromosomes puisqu'il s'agit d'un échange entre chromosomes homologues, cela signifie que dans le cadre d'une recombinaison homologue hors travail du génie génétique, il y aura forcément modification des deux chromosomes. Néanmoins tu as raison, les allèles peuvent être modifiés à moitié seulement.

Si tu fais de la recombinaison homologue dans le cas d'une transgenèse sur un zygote, c'est nécessairement crispr/cas9 (la RH classique s'applique sur des cellules souches embryonnaires) donc tu peux de toute manière changer les deux allèles. Cela dit, si tu cherches à éliminer une mutation dominante - pas récessive - produisant des effets négatifs, avec une RH par crispr/cas9, en ne la supprimant que sur la moitié des allèles, tu auras des effets négatifs tout de même je pense.

J'espère que je suis pas parti trop loin de ta question.. 

 

Le 29/05/2020 à 19:39, miss_tinguette a dit :

Dans le cours de bettina, lors d’une recombinaison homologue pour générer un individus KO pour une gène donné, il faut attendre plusieurs génération c’est ca ? parce que les individus « chimère » sont tout au plus hétérozygotes donc pas totalement KO… ou si ? (a moins que le chromosome transgénique soit dominant par rapport au sauvage ?)

Non c'est bien cela dans tous les cas puisque le KO concerne la suppression du gène, le chromosome restant continuera à être exprimé. Il faut donc plusieurs générations pour obtenir un individu homozygote KO avec une RH.

 

Le 29/05/2020 à 19:39, miss_tinguette a dit :

Dans le même style (ouais c’est sûr il y a un truc que je comprends pas) : « Pour obtenir un animal KO pour un gène donné, on va remplacer le gène en question par une cassette d'expression codant pour un gène inerte, on a donc éliminé le gène d'intérêt. » compté vrai mais il reste quand même sur l’autre chromosome non touché non ?

Dans cet item on parle de gène donc en restant très général, on a remplacé un gène par une cassette d'expression = on a modifié tout le gène cad toute la partie du génome qui contenait le gène d'intérêt. L'item "pour obtenir un animal KO pour un gène donné chez un individu homozygote pour le gène d'intérêt, on va remplacer le gène sur un chromosome par une cassette d'expression codant pour un gène inerte, on a donc éliminé le gène d'intérêt" aurait été faux, mais comme on reste très général en disant gène faut pas chercher plus loin t'inquiète ! 

 

Le 29/05/2020 à 19:39, miss_tinguette a dit :

merciiii d'avance !! 

de rien ! 

 

[Ju_geote]

@windu merci beaucoup beaucoup !!! par contre pour ma deuxième question, lorsque l'on fait une recombinaison homologue sur zygote on utilise un vecteur ADN donneur pour justement le recopier sur un chromosome qui aura été coupé sur ses deux brins, donc on ne recopia pas le deuxième chromosomes, donc je croyais que le deuxième n'était pas touché, a moins qu'on mette deux plasmides donneurs d'ADN dans le zygote, ciblant chacun un chromosome, c'est pour ca que je me demandé si, meme si il seul chromosome était touché (si un seul plasmide donneur a été inséré), on pouvait quand même parler de KO ou KI  

[windu]

il y a 6 minutes, miss_tinguette a dit :

@windu merci beaucoup beaucoup !!! par contre pour ma deuxième question, lorsque l'on fait une recombinaison homologue sur zygote on utilise un vecteur ADN donneur pour justement le recopier sur un chromosome qui aura été coupé sur ses deux brins, donc on ne recopia pas le deuxième chromosomes, donc je croyais que le deuxième n'était pas touché, a moins qu'on mette deux plasmides donneurs d'ADN dans le zygote, ciblant chacun un chromosome, c'est pour ca que je me demandé si, meme si il seul chromosome était touché (si un seul plasmide donneur a été inséré), on pouvait quand même parler de KO ou KI  

Ok oui je comprends ta question ! Alors du coup je distinguerais KO et KI. Il me semble que le KO et le KI sont définis au niveau des gènes, donc c'est le résultat du travail génétique au niveau du gène qui détermine s'il s'agit bien du KO et du KI. 

Tu peux pas faire de RH sur un zygote pour obtenir un KO : soit tu fais sur une cellule ES et tu peux faire un KO par RH, soit tu utilises la recombinaison non homologue sur un zygote - avec crispr/cas9. Donc pour le KO c'est pas possible, d'autant que modifier un seul chromosome signifie laisser une partie du gène valide donc même par recombinaison non homologue pour moi c'est impossible de parler de KO si tu laisses le gène actif quelque part. 

Pour le KI, c'est à partir du moment où le gène est remplacé, donc si tu fais une RH sur zygote avec crispr/cas9 et que tu ne changes qu'un chromosome, ce serait en fonction de son caractère récessif ou dominant que tu détermines si le KI est atteint ou non. Si le gène initial ne s'exprime plus c'est bien un KI et si le gène initial est dominant ce n'en est pas un.

Après peut-être qu'il faudrait demander confirmation à un RM mais je pense que ça fonctionne de cette manière