QCM immuno

[Wonder]

Bonjour, les 3 qcms suivants me posent soucis, désolé pour toutes ces questions, merci par avance !! 

 

QCM 6 
Vous souhaitez produire des anticorps monoclonaux (ACm) de souris spécifiques du cancer (humain) de l’ovaire pour une utilisation diagnostique et thérapeutique. Vous disposez de tissu ovarien normal et cancéreux (tumoral) et d’une lignée cellulaire humaine (Co) dérivée du même cancer. Vous avez immunisé une série de souris avec un extrait protéique de la lignée Co et vous mettez en œuvre la production d’ACm selon la technologie des hybridomes Vous avez criblé les surnageants en immunohistochimie sur la ligné Co, ce qui vous a conduit à sélectionner 5 ACm (A, B, C, D et E) dont vous analysez la réactivité en dot blot et en immunotransfert sur des extraits de protéines hydrosolubles de vos tissus ovariens.

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/rd9a.png

Pour la C qui est fausse : c'est parce que l'on observe une bande à 70kd mais il nous en faudrait une autre à 30 kd car 70+30=100 kd ? 

Pour la E, qui est vraie, je ne comprends pas comment on peut affirmer qu'il est conformationnel alors que nous ne sommes pas en conditions réductrices ? 

 

Celui ci en lien avec le 6, me pose soucis, la seule juste est la A : QCM 7
Vous souhaitez développer des tests diagnostiques du cancer ovarien reposant sur le dosage de protéines spécifiques de celui-ci dans le sérum des patients. Au préalable, vous cherchez si les protéines reconnues par vos anticorps sont « libérées » (sécrétées ou libérées par clivage) par les cellules cancéreuses.

A. Grâce au couple d’ACm A et E, vous pouvez évaluer par ELISpot la capacité des cellules Co à libérer P dans le surnageant de culture.

2. Grâce au couple d’ACm D et E, vous pouvez évaluer par ELISpot la capacité des cellules Co à libérer P dans le surnageant de culture

3. Le couple d’ACm A et B est plus approprié que le couple d’ACm A et E pour développer un ELISA « sandwich » permettant le dosage de P

4. Le couple d’ACm A et C pourrait permettre de doser P en ELISA indirect dans le surnageant des cellules Co en culture

5. L’ACm D ne peut pas être utilisé dans un test diagnostique car il n’est pas spécifique du cancer ovarien

 

QCM 9 : Afin d’identifier de nouveaux marqueurs sériques du cancer, vous a analysez l’ensemble des protéines sécrétées (sécrétome) par une lignée cellulaire « C » dérivée d’un cancer du pancréas. Vous identifiez des polypeptides provenant d’une protéine de la famille des protéines membranaires Tat qui comprend plusieurs isoformes de tailles variables résultant d’un épissage alternatif.
Vous étudiez l’expression de Tat dans les cellules normales (N) du pancréas et dans la lignée C, grâce à un antisérum de lapin (AS) parfaitement caractérisé, spécifique de Tat, qui reconnaît toutes les formes et tous les fragments de Tat. Vous utilisez également deux anticorps monoclonaux de souris, AC1 et AC2, dont la spécificité anti-Tat a été clairement établie.

A partir des cellules N, vous réalisez un extrait protéique total contenant toutes les protéines cellulaires, dont on considérera dans la suite du problème qu’il ne contient aucune protéine du sécrétome. Vous analysez cet extrait en conditions non dénaturantes, par « dot blot ». L’intensité du marquage varie de 0 à 2. Vous analysez ensuite le même extrait, en conditions dénaturantes, par immunoempreinte après électrophorèse en PAGE-SDS

(« Western blot »). Vous analysez ensuite les cellules C de la même manière que précédemment. On considérera ici aussi que l’extrait protéique total ne contient aucune protéine du sécrétome. Les résultats sont représentés ci-dessous.

https://zupimages.net/viewer.php?id=20/15/3tu1.png : je ne comprends pas comment on peut affirmer la A de façon certaine (elle est donc vraie)

 

 

QCM 11 : Vous pensez que certaines formes (ou fragments) de Tat, spécifiquement présentes dans les cellules cancéreuses, pourraient constituer un marqueur diagnostique du cancer du pancréas. Vous pouvez rechercher ces formes (ou fragments) soit dans le sérum (protéines libérées par la tumeur), soit dans le tissu pancréatique, soit au niveau de cellules cancéreuses qui se sont détachées de la tumeur pancréatique et circulent dans le sang des patients (cellules cancéreuses circulantes).
La(les)quelle(s) de ces techniques vous semble(nt) adaptée(s) pour identifier les patients atteints de cancer du pancréas ?

1. Sur cryocoupes tissulaires, un marquage avec l’AS vous permettra de distinguer les cellules normales des cellules cancéreuses

 

 

[Metallica]

Salut @Wonder

 

il y a une heure, Wonder a dit :

Pour la C qui est fausse : c'est parce que l'on observe une bande à 70kd mais il nous en faudrait une autre à 30 kd car 70+30=100 kd ? 

 

Ce qui tu dis marche si on considère que l'épitope reconnu par l'ACm C est présent sur les fragments de 70kDa et de 30kDa sauf qu'il peut parfaitement être sur une seule des deux formes (en l’occurrence ça serait sur celle de 70kDa). Ça pourrait être du à clivage protéolytique de la protéine P mais ça pourrait tout aussi bien être une réaction croisée (avec une autre protéine de l'extrait utilisé) donc on ne peut pas affirmer que cet Ac reconnait une forme clivée. De plus si c'était vraiment une forme clivée, ça serait étrange qu'on observe aucune bande à 70kDa (ou à 30kDa) pour tous les autres Ac utilisés qui visiblement reconnaissent eux aussi la protéine P.

 

il y a une heure, Wonder a dit :

Pour la E, qui est vraie, je ne comprends pas comment on peut affirmer qu'il est conformationnel alors que nous ne sommes pas en conditions réductrices ?

 

Si on l'est avec l'immunotransfert (partie de droite de chaque expérience) et vu que l'on un signal en dot-blot pour l'AcmE , signal absent en immunotrasnfert , on peut en deduire que cet Ac reconnait un épitope conformationnel

 

il y a une heure, Wonder a dit :

A. Grâce au couple d’ACm A et E, vous pouvez évaluer par ELISpot la capacité des cellules Co à libérer P dans le surnageant de culture.

2. Grâce au couple d’ACm D et E, vous pouvez évaluer par ELISpot la capacité des cellules Co à libérer P dans le surnageant de culture

3. Le couple d’ACm A et B est plus approprié que le couple d’ACm A et E pour développer un ELISA « sandwich » permettant le dosage de P

4. Le couple d’ACm A et C pourrait permettre de doser P en ELISA indirect dans le surnageant des cellules Co en culture

5. L’ACm D ne peut pas être utilisé dans un test diagnostique car il n’est pas spécifique du cancer ovarien

 

Okok alors on est parti

 

A. Vrai. Oui en utilisant les étapes d'un ELISA sandwich on pourra utiliser les Ac A et E reconnaissant respectivement un épi séquentiel et conformationnel (c'est l'idéal) de P donc on pourra effectivement procéder à un ELISpot pour tester les capaciter des cellules Co à secreter P

 

B.Faux. L'AC D reconnait une protéine de 80kDa, certes présente uniquement dans la tumeur mais qui n'a pas l'air d’être apparentée à P (sans doute pas une forme clivée pour les mêmes raisons que j'ai évoquées dans l'item C du QCM6)

 

C. Les deux couples permettront le dosage mais comme je l'ai dit dans l'item A , l'idéal c'est d'avoir deux AC reconnaissant 2 épitopes différents du coup la paire d'AC A/E sera plus adaptée au dosage.

 

D. On utilisera l'ELISA sandwich pour doser P pas un ELISA indirect

 

E.Il ne sera sans doute pas utilisable si on utilise la reconnaissance de P pour le test diagnostic en revanche il est bien spécifique d(un Ag présent uniquement dans les tissus cancereux ovarien (dot-blot en haut à gauche de ton image)

 

 

il y a une heure, Wonder a dit :

e ne comprends pas comment on peut affirmer la A de façon certaine (elle est donc vraie)

 

pour le sécrétome, tu vois que l'AS et l'AC1 permettent d'obtenir une bande à 400kDa , ça veut donc dire que c'est le fragment de 400kDa qui est dans le surnageant. De plus tu vois un signal en dot-bot (utilisé avec le sécrétome) associé à l'AC2,signal absent en immunotransfert. A partir de là tu peux en conclure que l'AC2 reconnait un épi conformationnel sur le fragment de 400kDa (vu que c'est lui qui a été sécrété)

 

 

il y a une heure, Wonder a dit :

Sur cryocoupes tissulaires, un marquage avec l’AS vous permettra de distinguer les cellules normales des cellules cancéreuses

 

(item C)

 

Voilou

Edited April 6, 2020 by Metallica

[Wonder]

Il y a 11 heures, Metallica a dit :

Si on l'est avec l'immunotransfert (partie de droite de chaque expérience) et vu que l'on un signal en dot-blot pour l'AcmE , signal absent en immunotrasnfert , on peut en deduire que cet Ac reconnait un épitope conformationnel

un immunotransfert est toujours dénaturant ? 

 

merci infiniment !!

Edited April 7, 2020 by Wonder

[LdvMstr]

Coucou, 

 

S'il n'y a pas de précision dans l'énoncé t'indiquant que l'immunotransfert n'est pas dénaturant, alors il faut considérer qu'il est. 

• La prof vous indiquera dans l'intitulé de l'énoncé si l'immunotransfert n'est pas dénaturant, si il n'y a rien de préciser c'est que ton immunotransfert est dénaturant.
• Donc considère ton immunotransfert comme toujours dénaturant sauf preuve du contraire.

Edited April 7, 2020 by LdvMstr

[Wonder]

il y a une heure, LdvMstr a dit :

Coucou, 

 

S'il n'y a pas de précision dans l'énoncé t'indiquant que l'immunotransfert n'est pas dénaturant, alors il faut considérer qu'il est. 

• La prof vous indiquera dans l'intitulé de l'énoncé si l'immunotransfert n'est pas dénaturant, si il n'y a rien de préciser c'est que ton immunotransfert est dénaturant.
• Donc considère ton immunotransfert comme toujours dénaturant sauf preuve du contraire.

merci !