[REMARQUES RECHERCHE COLLE GFORM]

[AB-EL]

Hey Maraich' !

 

Voici le post sous lequel vous pouvez poster vos éventuelles erratas/remarques/questions concernant le module UE8 RECHERCHE.

 

On vous souhaite plein de courage  

 

Tutobise hygiénique  

[Hypnos]

bonjour,

merci pour cette colle,

mais lors de la réalisation il y a un problème à l'item 5E, sur le WB il y a un décalage de 20 pb en bas et en haut, et donc les WB sont faux de ce fait, est-ce normal ?

En effet , le bon plasmide devrait donner après digestion à ECOR1 un fragment de 2370 et un de 7730pb, or il semble que vous ayez pris celui incorrect (dont le valeurs sont justes) en décalant uniquement de 20pb au lieu de 40pb, mais je ne pense pas que ce soit un but de piéger là, d'autant plus avec la précision de WB

Edited March 27, 2020 by Paracelse

[Man-ondansétron]

Bonjour @Paracelse,

Oui tu as raison j'ai du m'embrouiller dans mes calculs, en prenant le site EcoR1 comme s'il était à 100 pb du début de l'insert au lieu de 120. En effet ce n'était pas un piège, juste une erreur de ma part. J'espère que cela ne t'as pas induit en erreur.

Bon courage pour la suite!

 

[Hypnos]

1 minute ago, Man-ondansétron said:

Bonjour @Paracelse,

Oui tu as raison j'ai du m'embrouiller dans mes calculs, en prenant le site EcoR1 comme s'il était à 100 pb du début de l'insert au lieu de 120. En effet ce n'était pas un piège, juste une erreur de ma part. J'espère que cela ne t'as pas induit en erreur.

Bon courage pour la suite!

 

Non c’est bon, je me suis dit que c’était un peu oublie en retrouvant le raisonnement 

 

merci encore

[AthosPorthosAramisDartos]

Salutation, merci pour cette colle,

J'ai une question concernant le qcm 5, l'item C; pour le clone 1 comment l'analyse par WB de la digestion du plasmide par EcoR1 pourrait il donner 2 bandes distinctes si le plasmide n'a pas intégré l'insert? Il n'y a qu'un seul site de restriction EcoR1 sur le plasmide natif.

Edited March 29, 2020 by AthosPorthosAramisDartos

[Juliethmoïde]

Il y a 2 heures, AthosPorthosAramisDartos a dit :

Salutation, merci pour cette colle,

J'ai une question concernant le qcm 5, l'item C; pour le clone 1 comment l'analyse par WB de la digestion du plasmide par EcoR1 pourrait il donner 2 bandes distinctes si le plasmide n'a pas intégré l'insert? Il n'y a qu'un seul site de restriction EcoR1 sur le plasmide natif.

Tu as raison il s'agit d'une erreur. Si le plasmide n'a pas intégrer l'insert il possède bien un seul site de restriction reconnu par EcoR1 par conséquent il devrait donc y avoir une seule bande sur le Western Blot. 

[Hypnos]

Bonjour, après avoir pris connaissance de la correction, certaines points restent à éclaircir

 

Au sujet de l'item 2D

Alors, je ne vois pas ce qui nous dit que FUN-ABC interagit avec PURPAN-ABC, car pour MARAICCH, on a bien modification de la quantité de MARAICH sans FUN, mais pas de PURPAN de ce fait, je ne vois pas quel argument peut justifier cette interaction

 

Au sujet de l'item 4B, vous dites que l'on peut retrouver un monomère de la molécule C, mais j'aimerais savoir n quoi une chromatographie d'exclusion est dénaturante, surtout sans le préciser ?

 

Au sujet de la 5A, je ne vois pas l'utilité ni l'avantage à utiliser BamH1 et Xho1, sachant que la première coupe avant la seconde

donc on va tenir le fragment d'intérêt avec deux extrémité BAMH1, et un petit fragment BAMH1 et Xho1 en extrémité qui lui ira se mettre dans le plasmide digéré par le même enzyme, et donc on perd totalement notre séquence d'intérêt 

 

 voilà voilà merci pour cette colle

[Juliethmoïde]

Salut!

Alors pour l'item 2B on réalise un pull down avec des billes ayant une affinité pour PURPAN-ABC et MARAÎCHERS-ABC. Dans la première colonne On voit qu'après le pull down on récupère MARAÎCHERS-ABC et PURPAN-ABC (logique les billes ont de l'affinité pour ces protéines) ainsi que FUN-ABC ce qui signifie que cette protéine interagit soit avec MARAICHERS-ABC soit avec PURPAN-ABC soit avec les deux. Ensuite dans la troisième colonne on voit que sans la protéine PURPAN-ABC on récupère quand même FUN-ABC. On peut donc en déduire que MARAICHERS-ABC interagit avec FUN-ABC. Et dans la quatrième colonne c'est l'inverse on voit que sans MARAÎCHERS-ABC on récupère quand même FUN-ABC ce qui veut dire que PURPAN-ABC et FUN-ABC interagissent ensemble. Enfaîte on ne s'intéresse pas à la deuxième colonne qui nous montre juste qu'en absence de FUN-ABC il y a une diminution de l'expression de MARAÎCHERS-ABC.
J'espère que mon explication est assez claire.

 

Pour l'item 4B la question à été posée dans le forum recherche, voici la réponse :

Il y a 2 heures, AdamDeSagesse a dit :

Hey ! 

Cet item fait référence à un exemple traité dans le cours, où l'on observe un décalage dans le chromatogramme, révélant que la protéine existe sous forme monomère et multimère.

  Révéler le contenu masqué

 

Avec du recul, je suis d'accord avec toi : il manque des précisions et c'est posé de manière très maladroite (je m'en excuse). Dans l'exemple du cours, l'IgG est présent sous forme de monomère et de multimère, mais en aucun cas les formes multimères ne sont réduites. Les deux coexistent dans le surnageant de culture.

Or, dans ce QCM, la protéine B est vraisemblablement uniquement sous forme dimère et en effet, il n'y a pas de raison qu'elle soit réduite en monomère. Il aurait fallu dire qu'il existait sous forme monomère et dimère. (Je m'occupe de faire remonter l'erratum)

 

Désolé encore ! Bonne journée et bon courage !

 

Pour l'item 5A je suis d'accord avec toi je pense qu'il s'agit d'une erreur. Le clonage pourrait être réalisé par BamH1 et Xho1 s'il n'y avait pas de sites de restriction reconnu par BamH1 au niveau du codon stop.

Voilà j'espère que c'est plus clair pour toi ! Bonne soirée !

Edited March 29, 2020 by Juliethmoïde

[lec31]

Salut, à propos de l'item 4D, j'ai marqué dans mon cours que le volume mort correspondait au volume nécessaire à l'élution des protéines exclues, du coup j'en ai déduit que c'était les plus grosses dans le cas d'une chromatographie d'exclusion. Mais la correction contredit ça, du coup le volume mort correspondrait au volume d'élution de quelles protéines, si ce n'est pas celles de plus haut PM et du coup exclues ?

Merci !

[AdamDeSagesse]

il y a 33 minutes, lec31 a dit :

Salut, à propos de l'item 4D, j'ai marqué dans mon cours que le volume mort correspondait au volume nécessaire à l'élution des protéines exclues, du coup j'en ai déduit que c'était les plus grosses dans le cas d'une chromatographie d'exclusion. Mais la correction contredit ça, du coup le volume mort correspondrait au volume d'élution de quelles protéines, si ce n'est pas celles de plus haut PM et du coup exclues ?

Merci !

 

Le volume mort correspond au volume entre les billes. On peut aussi le définir comme le volume qui permet d’éluer les molécules de taille supérieure aux pores = celles qui sont non retenues, soit des molécules de haut poids moléculaire. Donc, tu n'as pas tord mais il faut distinguer "molécule de haut poids moléculaire" et "molécule de plus haut poids moléculaire dans un contexte donné" : on se sait pas si celle présentée dans le QCM est retenue ou non. Si elle n'est pas retenue, alors oui, son volume d'élution correspond au volume mort.

 

Toutefois, je t'avoue avoir quelques réserves. Quelqu'un a pris l'initiative de demander à la professeure si le volume mort était une propriété intrinsèque à la colonne ou non. J'ai répondu en partant de principe que c'était le cas.

Edited March 29, 2020 by AdamDeSagesse

[lec31]

il y a 15 minutes, AdamDeSagesse a dit :

 

Le volume mort correspond au volume entre les billes. On peut aussi le définir comme le volume qui permet d’éluer les molécules de taille supérieure aux pores = celles qui sont non retenues, soit des molécules de haut poids moléculaire. Donc, tu n'as pas tord mais il faut distinguer "molécule de haut poids moléculaire" et "molécule de plus haut poids moléculaire dans un contexte donné" : on se sait pas si celle présentée dans le QCM est retenue ou non. Si elle n'est pas retenue, alors oui, son volume d'élution correspond au volume mort.

 

Toutefois, je t'avoue avoir quelques réserves. Quelqu'un a pris l'initiative de demander à la professeure si le volume mort était une propriété intrinsèque à la colonne ou non. J'ai répondu en partant de principe que c'était le cas.

 

ah oui ça parait logique comme ça, merci beaucoup ! j'irais voir la réponse de la prof aussi si ça a été posté sur Moodle

[Mazlo]

Hello ! J'ai deux petits soucis :

 

Le premier concerne le QCM2 : Je pensais que la technique de Pull Down ne servait qu'à refléter les interactions entre deux protéines déjà produites (et donc qu'il n'y avait aucun rapport avec l'impact ou la quantification de leur expression). Quelqu'un pourrait m'expliquer comment cette technique marche exactement ? ^^'

 

Ensuite pour l'item 8A et B : Si on cherche à faire un antisérum de chèvre à partir d'IgM de souris spécifiquement, pourquoi est ce qu'on ne peut pas le fabriquer en injectant des IgM de souris ou des FaB à la chèvre ?

 

Voilà ! Encore merci beaucoup pour cette colle de qualité

[Juliethmoïde]

Salut ! @Mazlo

Alors pour le qcm 2 l'item est bien faux mais tu as raison il y a une erreur dans la correction. Le pull down ne modifie pas l'expression de la protéine. C'est une technique qui permet d'étudier les interactions entre les protéines. Pour cela on utilise des appâts (classiquement des billes) qui vont avoir une affinité pour une protéine ou un domaine protéique particulier. Lorsqu'on réalise le pull down on va retirer des protéines de l'extrait cellulaire cependant on ne touche absolument pas à leur expression!

 

Ensuite pour le QCM 8 on cherche à produire des anticorps spécifiques des IgM de souris. Si on injecte à la chèvre des IgM de souris on va obtenir certes des anticorps dirigés contre les IgM de souris mais également des anticorps dirigés contre les chaînes légères (kappa et lambda). Les anticorps produits vont donc reconnaître d'autres classes d'anticorps et ne seront pas spécifiques des IgM. Pour l'item B c'est la même chose. Si on injecte un Fab de souris à une chèvre (même en admettant qu'il proviennent d'une IgM) on va aussi obtenir des anticorps dirigés contre les chaînes légères. Seule la chaîne μ est spécifique des IgM. Il faudrait donc injecter des chaînes μ de souris à la chèvre pour obtenir uniquement des anticorps dirigés contre les IgM de souris. Je te mets un petit schéma du cours de B. Segui histoire de mieux comprendre tout ça ! 

J'espère que c'est plus clair pour toi ! Bonne soirée et bon courage !!

Edited March 29, 2020 by Juliethmoïde

[Mazlo]

Il y a 13 heures, Juliethmoïde a dit :

Alors pour le qcm 2 l'item est bien faux mais tu as raison il y a une erreur dans la correction. Le pull down ne modifie pas l'expression de la protéine. C'est une technique qui permet d'étudier les interactions entre les protéines. Pour cela on utilise des appâts (classiquement des billes) qui vont avoir une affinité pour une protéine ou un domaine protéique particulier. Lorsqu'on réalise le pull down on va retirer des protéines de l'extrait cellulaire cependant on ne touche absolument pas à leur expression!

Ok du coup la C devrait aussi être fausse puisque ça parle d'une diminution de l'expression de MARAICHERS-XYZ par l'absence de FUN-ABC alors que c'est plutôt une diminution de l'interaction ?

 

Il y a 13 heures, Juliethmoïde a dit :

Ensuite pour le QCM 8 on cherche à produire des anticorps spécifiques des IgM de souris. Si on injecte à la chèvre des IgM de souris on va obtenir certes des anticorps dirigés contre les IgM de souris mais également des anticorps dirigés contre les chaînes légères (kappa et lambda). Les anticorps produits vont donc reconnaître d'autres classes d'anticorps et ne seront pas spécifiques des IgM. Pour l'item B c'est la même chose. Si on injecte un Fab de souris à une chèvre (même en admettant qu'il proviennent d'une IgM) on va aussi obtenir des anticorps dirigés contre les chaînes légères. Seule la chaîne μ est spécifique des IgM. Il faudrait donc injecter des chaînes μ de souris à la chèvre pour obtenir uniquement des anticorps dirigés contre les IgM de souris. Je te mets un petit schéma du cours de B. Segui histoire de mieux comprendre tout ça ! 

AAAH D'accoooord c'est uniquement avec des chaines lourdes que ce sera spécifique ! Ok j'avais pas capter ça.

 

Il y a 13 heures, Juliethmoïde a dit :

J'espère que c'est plus clair pour toi ! Bonne soirée et bon courage !!

C'est super merci beaucoup !

[Juliethmoïde]

Salut @Mazlo

Oui tu as raison la 2C est un peu ambiguë. Dans la deuxième colonne on constate bien qu'on récupère moins de MARAÎCHERS-XYZ lorsque l'on réalise le pull down en absence de FUN-ABC. En revanche tu as raison on ne peux pas savoir s'il s'agit d'une diminution de l'expression de MARAÎCHERS-XYZ. Une diminution de son expression aurait bien pour conséquence une diminution de sa quantité dans l'extrait cellulaire, ce qui pourrait expliquer les résultats. Cependant il pourrait aussi s'agir d'un défaut d'interaction de MARAÎCHERS-XYZ avec la bille. L'item aurait pu être vrai si il était écrit "la diminution de la quantité de MARAÎCHERS-XYZ en absence de FUN-ABC peut être due à une diminution de son expression" 

Voilà j'espère que c'est plus clair pour toi!

[Mazlo]

Okiii merci @Juliethmoïde!

[Hypnos]

@Juliethmoïde et @AdamDeSagesse

 

merci

[LeMathou]

Bonjour, 

J'ai une question sur la 4E, vous expliquez que "Si la limite d’exclusion avait été de 1000 kDa, le chromatogramme n’aurait présenté que 2 pics". J'ai compris que lorsqu'on imposait une limite, tout ce qui était au dessus (de cette limite) représenterait le volume mort. Or de base on a bien 3 pics (sans cette limite), mais si on impose cette limite seules les protéines de 1500kDa représenteront ce volume mort, et les autres seront différenciées sous formes de 500kDa et sous forme de 1000kDa (avec la logique énoncée au dessus du mono/dimère). Or comme le montre le graphique illustrant le chromatographie d'exclusion (vu en cours) le volume mort à sa représentation. Bref du coup je vois pas trop pourquoi il n'y aurait seulement 2 pics, à part si on prend en compte que toutes les protéines de 1000kDa sont sous forme de dimère (le pic de 500 kDa + le volume mort), non? 

J'espère que c'est compréhensible, merci d'avance pour une réponse ! 

Merci également pour cette colle !!! 

 

Edited March 30, 2020 by LeMathou

[AdamDeSagesse]

Révélation

il y a 42 minutes, LeMathou a dit :

Bonjour, 

J'ai une question sur la 4E, vous expliquez que "Si la limite d’exclusion avait été de 1000 kDa, le chromatogramme n’aurait présenté que 2 pics". J'ai compris que lorsqu'on imposait une limite, tout ce qui était au dessus (de cette limite) représenterait le volume mort. Or de base on a bien 3 pics (sans cette limite), mais si on impose cette limite seules les protéines de 1500kDa représenteront ce volume mort, et les autres seront différenciées sous formes de 500kDa et sous forme de 1000kDa (avec la logique énoncée au dessus du mono/dimère). Or comme le montre le graphique illustrant le chromatographie d'exclusion (vu en cours) le volume mort à sa représentation. Bref du coup je vois pas trop pourquoi il n'y aurait seulement 2 pics, à part si on prend en compte que toutes les protéines de 1000kDa sont sous forme de dimère (le pic de 500 kDa + le volume mort), non? 

J'espère que c'est compréhensible, merci d'avance pour une réponse ! 

Merci également pour cette colle !!! 

 

 

 

Hey !

Dire que la limite d'exclusion est de 1000 kDa, cela revient à dire que les molécules de 1000 kDa ou plus ne sont pas retenues. Si je comprends bien, tu pars du principe que ce n'est que ce qui est strictement supérieure à cette limite, mais ça vaut également pour les molécules dont le poids correspond à la limite, sauf erreur de ma part. 

Et puis, quand bien même elle soit un peu retenu, la différence ne permettrait pas de distinguer 2 pics.

 

Et donc, partant de ce principe, on a un pic qui correspond à tout ce qui n'est pas retenu (molécules de 1500 kDa et 1000 kDa) puis un pic pour la molécule de 500 kDa.

 

J'espère que c'est plus clair ainsi !

[LeMathou]

@AdamDeSagesse Je sais pas trop, dans la correction du TD il n'y a pas de précisions,  d'après la correction ça laisse sous entendre strictement supérieur à la limite... mais sinon je suis d'accord avec toi (je trouve ça plus logique d'ailleurs) mais je m'étais faite la réflexion par rapport à ce td.. 

merci !!!

 

 

Edited March 30, 2020 by LeMathou

[AdamDeSagesse]

il y a 16 minutes, LeMathou a dit :

@AdamDeSagesse Je sais pas trop, dans la correction du TD il n'y a pas de précisions,  d'après la correction ça laisse sous entendre strictement supérieurs à la limite... mais sinon je suis d'accord avec toi mais je m'étais faite la réflexion par rapport à ce td.. 

merci !!!

 

 

 

Je te rassure, il n'y aura certainement pas de piège sur ça le jour du concours (la molécule aura un poids soit strictement inférieure, soit strictement supérieure ; désolé de ne pas avoir anticipé cette manière de voir cette item) !

Il est vrai que l'on peut lire ça, mais je ne pense vraiment pas que ça exclue le fait que les molécules du même poids que la limite soit excluent aussi : si tu as un doute, n'hésite pas à envoyer un message à l'un des professeurs, il saura mieux te répondre. Mais encore une fois, aucun risque qu'on piège sur ça le jour du concours ! Vraiment désolé pour le doute engendré !

Edited March 30, 2020 by AdamDeSagesse

[LeMathou]

@AdamDeSagesse il n'y a aucun problème, oui oui j'ai regardé les annales (et même ce td) prennent à chaque fois des valeurs bien inférieures ! 

En tout casmerci pour avoir pris du temps pour répondre 

[MaD]

Bonjour, @Juliethmoïde @AdamDeSagesse

 

j'ai un probleme avec la correction du 1E. Comment peut-on en déduire que la protéine existe sous différentes formes (dimère, trimère etc..)?

 

Dans le TD qcm14 on a la même chose à peu de choses près on retrouve un épaulement et dans la correction il est ecrit ca: " La présence d’un pic d’élution unique n’a aucun rapport avec la forme sous laquelle on récupère la protéine qui peut être monomérique, dimérique, trimérique, etc. Cela signifie qu’il n’y a qu’un type de protéine. "

 

Donc si le pic unique montre la présence d'une unique protéine et non sa forme, comment l'épaulement peut il montrer cela? si il y'a un épaulement c'est que la fraction n'est ps pure et qu'on a plusieurs proteine?

 

[AdamDeSagesse]

Hey @MaD !

 

Dans le cours, la notion d'épaulement apparaît dans le cadre de la purification d'IgG (voir image plus bas) : cet épaulement-ci est révélateur de l'existence de ces mêmes IgG sous forme de monomères et multimères. En général, un épaulement peut être dû à plein de choses : à des formes oligomères différentes certes, mais aussi à une hétérogénéité conformationnelle du peptide étudié dans un sens plus large (comme une variation dans la séquence d'acides aminés par exemple…) ou tout simplement à une erreur dans la réalisation de la chromatographie... Autrement dit, ce que dit la correction du TD est vrai : (je cite) "La présence d’un pic d’élution unique n’a aucun rapport avec la forme sous laquelle on récupère la protéine qui peut être monomérique, dimérique, trimérique, etc. […] Il faut surtout retenir que la chromatographie par affinité ne donne pas d’indication sur l’état oligomérique d’une protéine."

 

Révélation

 

En revanche, dans la colle, on observe bien un épaulement et on se questionne sur la raison de cette épaulement justement. Au vu de l'unique exemple donné en cours, on peut en effet suggérer (et le choix du mot est important !) que la protéine existe sous différent forme polymère. On n'affirme rien, on propose une raison qui pourrait expliquer un épaulement, qui est par ailleurs le seule exemple (je crois) donné en cours !

 

J'espère que la réponse te convient ! Bonne soirée !