maestro Posted February 28, 2020 Share Posted February 28, 2020 Bonsoir Par rapport à ce qcm, j’aimerai juste comprendre pourquoi l’AC IV reconnait rien en IT mais il reconnait l’épitope en PAGE-SDS, comment il reconnait un épitope conformatonnel en page-SDS? je n’arrive pas à comprendre la subtilité de l'énoncé.. et par rapport à ce qcm, 11)C) FAUX, je suis d’accord avec la réponse, mais je ne comprends pas trop le but: est-ce qu’on veut remplacer la séquence sauvage par la séquence du vecteur c’est tt non? on veut pas exciser un quelconque exon là non? Merci d'avance et bon week-end Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Solution Metallica Posted February 28, 2020 Solution Share Posted February 28, 2020 (edited) Salut @maestro Il y a 15 heures, maestro a dit : Par rapport à ce qcm, j’aimerai juste comprendre pourquoi l’AC IV reconnait rien en IT mais il reconnait l’épitope en PAGE-SDS, comment il reconnait un épitope conformatonnel en page-SDS? je n’arrive pas à comprendre la subtilité de l'énoncé.. Oui c'est vrai que ça peut sembler contradictoire de faire un SDS-PAGE après une immunoprécipitation mais ça a du sens: En faisant en premier l'immunotransfert tu remarques qu'il n'y a aucun signal provoqué par l'AC IV , tu soupçonnes donc l'épitope reconnu d'etre un épitope conformationnel . Tu fais alors une immunoprécipitation (qui permet de conserver la structure native de l'Ag) de l'Ag complexé à l'Ac, une protéine de liaison et la bille permettant d'isoler le complexe par centrifugation. A partir de là si tu fais un SDS puis une immunodétection grâce à un autre Ac reconnaissant un épitope séquentiel de l'Ag et que tu as une bande tu pourras forcément déduire de par l’existence de cette bande isolée que lors de l'immunoprécipitation l'Ac a bien reconnu l'épitope et qu'il est forcément conformationnel car tu sais via l'immunotransfert qu'il ne reconnait pas d'épi séquentiel. Donc au final peu importe de faire un SDS après immunoprécipitation , tant que tu isoles ton complexe et que tu le compares à un immunotransfert tu pourras faire aisément tes déductions sur les types d'épitopes reconnus. Il y a 15 heures, maestro a dit : 11)C) FAUX, je suis d’accord avec la réponse, mais je ne comprends pas trop le but: est-ce qu’on veut remplacer la séquence sauvage par la séquence du vecteur c’est tt non? on veut pas exciser un quelconque exon là non? On cherche à invalider ce gène pour voir quelle importance il a dans le développement , ici ça ne sera effectivement pas avec l'excision de l’exon 2 mais plutôt par la disparition du codon initiateur ATG :)) ! Edited February 29, 2020 by Metallica Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
maestro Posted February 29, 2020 Author Share Posted February 29, 2020 J’ai tt compris merci eeeeeeencore @Metallica Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Metallica Posted February 29, 2020 Share Posted February 29, 2020 De rien avec plaisir Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Ancien du Bureau Please Posted April 2, 2020 Ancien du Bureau Share Posted April 2, 2020 Le 28/02/2020 à 21:18, Metallica a dit : En faisant en premier l'immunotransfert tu remarques qu'il n'y a aucun signal provoqué par l'AC IV , tu soupçonnes donc l'épitope reconnu d'etre un épitope conformationnel . Tu fais alors une immunoprécipitation (qui permet de conserver la structure native de l'Ag) de l'Ag complexé à l'Ac, une protéine de liaison et la bille permettant d'isoler le complexe par centrifugation. A partir de là si tu fais un SDS puis une immunodétection grâce à un autre Ac reconnaissant un épitope séquentiel de l'Ag et que tu as une bande tu pourras forcément déduire de par l’existence de cette bande isolée que lors de l'immunoprécipitation l'Ac a bien reconnu l'épitope et qu'il est forcément conformationnel car tu sais via l'immunotransfert qu'il ne reconnait pas d'épi séquentiel. Donc au final peu importe de faire un SDS après immunoprécipitation , tant que tu isoles ton complexe et que tu le compares à un immunotransfert tu pourras faire aisément tes déductions sur les types d'épitopes reconnus. (Re) Coucou @Metallica je t'avoue que ça fait bien 20minutes que j'essaye de comprendre mais je n'y arrive pas... Est-ce que tu saurais réexpliquer s'il te plait ? Je suis vraiment désolée Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Metallica Posted April 2, 2020 Share Posted April 2, 2020 (edited) il y a une heure, Please a dit : je t'avoue que ça fait bien 20minutes que j'essaye de comprendre mais je n'y arrive pas... Est-ce que tu saurais réexpliquer s'il te plait ? Je suis vraiment désolée Imaginons tu as un Ac qui reconnait un épi conformationnel , si tu fais un immunotransfert tu n'auras aucun signal jusque là tu es dac? Les résultats de cet immunotransfert t'amène à penser qu'il reconnait un épi conformationnel ce qui t'induit à faire une immunoprécipitation cad tout le protocole de liaison de l'Ag à l'Ac lui-même relié à une protéine fixée à une bille, ce protocole ayant pour but d'isoler ton complexe Ac-Ag par centrifugation. Si ton complexe Ac-Ag a été isolé du reste de l'extrait, alors tu pourras en conclure que la liaison Ac-Ag s'est bien faite et que donc si la liaison s'est faite c'est que forcément on est en présence d'un épitope conformationnel vu que tu n'as rien vu en immunotransfert. Sauf que pour savoir s'il a bien été isolé encore faut il le révéler ! C'est pour ça que l'on peut faire un immunotransfert (ou bien une autoradiographie si tu prémarques ton échantillon par un composé radioactif) pour ensuite diriger d'autres Ac spécifiques d'épi sequentiels de l'Ag (+Ac secondaires marqués). En faisant cette étape tu pourras voir une unique bande correspondant à la taille de ton Ag ce qui t'indiquera que l'immunoprécipitation a fonctionné et que donc la liaison à l'Ac a aussi fonctionné. Du coup une fois que l'immunoprecipitation proprement dite a été faite, ça n'a plus aucun impact d'appliquer des conditions dénaturantes sur l'Ag par contre si on altérait l'extrait protéique avant de faire l'immunoprécipitation, alors là oui effectivement, ça ne servirait à rien puisqu'on détruirait les épitopes conformationnels qu'on cherchait à révéler. ça te va ? Edited April 2, 2020 by Metallica Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Ancien du Bureau Please Posted April 2, 2020 Ancien du Bureau Share Posted April 2, 2020 il y a 7 minutes, Metallica a dit : Imaginons tu as un Ac qui reconnait un épi conformationnel , si tu fais un immunotransfert tu n'auras aucun signal jusque là tu es dac? Les résultats de cet immunotransfert t'amène à penser qu'il reconnait un épi conformationnel ce qui t'induit à faire une immunoprécipitation cad tout le protocole de liaison de l'Ag à l'Ac lui-même relié à une protéine fixé à une bille, ce protocole ayant pour but d'isoler ton complexe Ac-Ag par centrifugation. Si ton complexe Ac-Ag a été isolé du reste de l'extrait, alors tu pourras en conclure que la liaison Ac-Ag s'est bien faite et que donc si la liaison s'est faite c'est que forcément c'est un épitope conformationnel vu que tu n'as rien vu en immunotransfert. Sauf que pour savoir s'il a bien été isolé encore faut il le révéler ! C'est pour ça que l'on peut faire un immunotransfert (ou une autoradiographie) pour ensuite diriger d'autres Ac spécifiques d'épi sequentiels de l'Ag (+Ac secondaires marqués). En faisant cette étape tu pourras voir une unique bande correspondant à la taille de ton Ag ce qui t'indiquera que l'immunoprécipitation a fonctionné et que donc la liaison à l'Ac a aussi fonctionné. Du coup une fois que l'immunoprecipitation proprement dite a été faite ça n'a plus aucun impact d'appliquer des conditions dénaturantes sur l'Ag par contre si on altérait l'extrait protéique avant de faire l'immunoprécipitation, alors là oui effectivement, ça ne servirait à rien puisqu'on détruirait les épitopes conformationnels qu'on chercherait à révéler. ça te va ? D'accooooord whaouh c'est bon c'est enfin compris merci beaucoup beaucoup je n'avais pas saisi que l'autoradiographie mettait en jeu un nouvel Ac, merci bcp !! @Metallica Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Metallica Posted April 2, 2020 Share Posted April 2, 2020 il y a 3 minutes, Please a dit : e n'avais pas saisi que l'autoradiographie mettait en jeu un nouvel Ac, C'est bien l'immunotransfert qui met en jeu un nouvel Ac Pour l'autoradiographie, tu prémarques ton échantillon (avant de faire l'immunoprécipitation) par un isotope radioactif comme ça tu n'as pas à utiliser d'immunodetection ;)) il y a 5 minutes, Please a dit : merci beaucoup beaucoup Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Ancien du Bureau Fantôme Posted June 6, 2020 Ancien du Bureau Share Posted June 6, 2020 (edited) Salut, j'espère que même si le post est en résolu quelqu'un verra ce message, ou peut être que @Metallica pourra m'aider, je ne comprends pas les ABC , le C j'ai lu ce que vous dites, mais si ça avait été l'exon 2 il aurait été effacé du vecteur modifié ? Et la A et B je sais pas , je ne vois pas comment on déduis ça, j'ai du rater une étape ... Edited June 6, 2020 by R2019 Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Metallica Posted June 6, 2020 Share Posted June 6, 2020 il y a 35 minutes, R2019 a dit : je ne comprends pas les ABC , le C j'ai lu ce que vous dites, mais si ça avait été l'exon 2 il aurait été effacé du vecteur modifié ? Je sais pas si on aurait pu parler "d'excision" de l'exon mais bon dans tous les cas il aurait disparu si on avait inséré une cassette à l'intérieur de sa séquence il y a 38 minutes, R2019 a dit : Et la A et B je sais pas , je ne vois pas comment on déduis ça, j'ai du rater une étape ... Ce qui les rend faux c'est le mot "uniquement" , les souris cyt -/+ (hétérozygotes transgéniques) constitueront dans les 2 cas ,un contre exemple aux affirmations proposées Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Ancien du Bureau Fantôme Posted June 6, 2020 Ancien du Bureau Share Posted June 6, 2020 (edited) Pour le C ok, merci Par contre pour les A et B , je n'ai pas compris comment on savait que l'un donnait +/+ et l'autre -/- , même si tu me dis que c'est faux pour le "uniquement", en fait j'ai pas compris la base ... Désolée ! Ah oui , mais en fait c'est juste que les 1 et 2 c'est le vecteur savage donc +/+ , et le 2 et 3 modifié donc -/- ? Mais du coup comment il y à les hétérozygotes ? Vraiment désolée je sais pas pourquoi j'arrive pas du tout à comprendre cet exercice là ! Ah oui, je crois que j'ai enfin à peu près compris cet exercice,après de très nombreuses relectures haha du coup la PCR se fait après toutes ces expériences, je crois que c'était ça mon problème, ca y est je crois que j'ai compris, merci metallica, j’arrête de vous embêter ! Merci ! Edited June 6, 2020 by R2019 Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Metallica Posted June 6, 2020 Share Posted June 6, 2020 il y a 23 minutes, R2019 a dit : du coup la PCR se fait après toutes ces expériences, je crois que c'était ça mon problème Ye,s tout se fait après avoir obtenu les animaux de la 3ème génération :)) Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Ancien du Bureau Fantôme Posted June 7, 2020 Ancien du Bureau Share Posted June 7, 2020 Ok, merci beaucoup ! Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
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