X-gal

[OxyGenS]

Bonsoir,

 

X-gal = Beta galactose + une autre mol° ou bien le substrat mis en présence des bactéries = beta-galactose + X-gal svp ?

Je crois que je n'ai pas compris parfaitement cette méthode... on met l'insert au milieu de la séquence de lacZ d'un plasmide de sorte à inactiver ce gène en qque sorte, ensuite on insère le plasmide recombinant dans des bactéries qui ne codent pas pour lacZ. On étale ces bactéries (avec le plasmide + celles sans l'insert incorporé donc lacZ intact) sur un gel et on les met en présence d'un substrat qui contient du beta-galactose et une autre mol° qui devient bleue lorsqu'elle est libre (X-gal?) --> là où ce sera bleu c'est l'endroit où on aura des bactéries sans l'insert et là où ce sera blanchâtre ce sera les bactéries à récupérer car contiennent l'insert ?

 

Merci

[Liliputienne]

Let's go te faire un petit topo récapitulatif et si c'est pas assez clair tu hésites pas  

 

Le principe ici c'est qu'on veut fabriquer un vecteur recombinant. Autrement dit insérer dans un vecteur (plasmide généralement) un insert. On passe les première étapes de préparation et de résistance à l'antibiotique pour aller directement au sujet qui nous intéresse : la sélection par la couleur du plasmide recombinant. 

 

Petits rappels préalables : 

• La β Galactosidase clive la lactose
• Xgal est une molécule non colorée liée à du βgalactose --> quand la liaison est coupée il y a coloration 

 

On prend des bactéries receveuses qui ne codent pas pour une βGalactosidase. Donc ces bactéries ne peuvent pas casser les liaisons du lactose.

On va utiliser un un plasmide (vecteur) portant le gène du Lac Z qui code pour la βGalactosidase. Le but est de mettre l’insert au milieu du Lac Z pour obtenir un vecteur recombinant.

De plus on donne substrat chromogène appelé Xgal à ces bactéries.

 

Il reste 3 cas de figures à partir de ce moment :

 

1 - Soit les bactéries reçoivent le vecteur non recombinant (càd que l’insert ne s’est pas mis au milieu du gène du Lac Z)

= Le vecteur possède un lac Z fonctionnel

= La bactérie produit de βGalactosidase

= Clivage du Xgal

= Les colonies deviennent bleues

 

2- Soit les bactéries reçoivent un vecteur recombinant (càd que l’incorporation de l’ADN d’intérêt à eu lieu au milieu du gène LacZ)

= Le gène est désorganisé

= La bactérie ne produit pas de βGalactosidase

= Pas de clivage de Xgal

= Les colonies sont blanches

 

 

3 - Enfin, celles ayant reçu un vecteur vide peuvent toujours coder le gène lacZ car il n’y a pas d’insert. Même cas de figure que le 1-

= Le vecteur possède un lac Z fonctionnel

= La bactérie produit de βGalactosidase

= Clivage du Xgal

= Les colonies deviennent bleues

 

Est-ce que c'est mieux pour toi ? 

 

 

[luv94]

Salut! 

Alors oui c'est ça, reprenons la méthode depuis le début:

On souhaite obtenir des bactéries, ayant intégré un vecteur recombinant contenant un insert de choix. Cependant, on veut pouvoir sélectionner parmi les bactéries ayant intégré un vecteur, celles qui ont intégré un vecteur recombinant (c'est-à-dire contenant l'insert). Pour cela, on va prendre au départ un vecteur vide contenant le gêne LacZ codant pour la bêta-galactosidase. Le site d'insertion pour ton insert est situé en plein milieu de LacZ, de ce fait: les bactéries ayant intégré le vecteur mais sans insert auront encore un gène LacZ valide et pourront exprimer la bêta galactosidase, tandis que celles ayant intégré le vecteur recombinant (avec l'insert) n'exprimeront pas la bêta galactosidase car leur LacZ sera invalidé. 

 

Pour la sélection, on va donc utiliser un substrat de la bêta galactosidase: le fameux X-gal! Lorsqu'on ajoute X-gal, si les bactéries expriment la bêta galactosidase elles vont l'hydrolyser et vont être colorées en bleu). Si elles n'expriment pas la bêta galactosidase (=bactéries ayant intégré le vecteur recombinant), elles ne pourront pas hydrolyser X-gal et vont rester blanches.

 

Voila pour la technique, n'hésite pas si ce n'est pas assez clair! 

[OxyGenS]

Merci pour vos réponses @Liliputienne @luv94

Du coup pour la technique c'est ok, j'ai bien compris.

Juste, il me reste une petite incompréhension par rapport à la composition du substrat (si on peut dire ça comme ça). Ce qu'on appelle substrat est bien le 'produit' qu'on ajoute sur le gel ? Ou ce qu'on appelle substrat c'est seulement X-gal ou alors carrément on ne fait pas la distinction ?

Et du coup le substrat c'est une molécule qui contient le beta-galactose et X-gal (chromogène) ou le substrat est X-gal avec X-gal = 1 beta-galactose + une mol° qui devient bleue quand liaison rompue ?

 

En espérant que vous cerniez mon interrogation concernant le vocabulaire

[luv94]

Du coup le substrat c'est le "produit" que tu ajoutes sur le gel, et c'est uniquement X-gal! C'est une molécule substrat de la beta galactosidase et c'est la réaction d'oxydation de X-gal qui libère un élément à l'origine de la coloration bleue. Ne te prend pas la tête avec tout ça vraiment le prof ne demande pas de genre de détails ! Il faut juste savoir ce que je t'ai dit dans le message précédent, à savoir : l'ajout de X-gal colore en bleu les cellules ayant intégré le vecteur vide et ne colore pas les cellules ayant intégré le vecteur recombinant

[OxyGenS]

Ok merci bcp @luv94

[luv94]

Avec plaisir