Orientation d'un ADNc dans un plasmide

[Cl02]

Coucou

Alors je n'ai pas d'exemple de QCM là mais je sais que je bloque toujours sur les questions sur lesquelles on a un ADNc qui possède 2 sites de restrictions pour des enzymes à ces extrémités et qu'on veut l'insérer dans un plasmide qui possède un MCS avec des sites pour ces mêmes enzymes et d'autres et je ne sais jamais quoi répondre quand on me demande s'il sera orienté dans le bon sens ou pas ... 

 

Ce serait cool si quelqu'un pourrait m'expliquer ce petit truc, mercciii

 

[Violette1]

Salut ! 

 

Tout d'abord il faut que tu repères quels sites de restriction ont des extrémités compatibles.

 

Un brin pourra s'orienter au hasard dans 2 directions dans le plasmide. 

Si toutes les extrémités ne sont pas compatibles entre le plasmide et le brin, d'un sens ou de l'autre, alors il n'y a pas d'insertion du brin ds le plasmide.

Si les extrémités sont compatibles entre le plasmide et le brin, d'un sens ou de l'autre, alors le brin à 50% de chances de s'insérer dans le bon sens (vu qu'il s'insère au hasard donc 1 chance sur 2).

Enfin, si d'un coté c'est compatible et de l'autre non, il faut regarder si le brin est bien orienté de la même façon que le plasmide :

- si oui, le plasmide est orienté dans le bon sens 

- si non, il est orienté dans le mauvais sens

 

J'espère que c'est plus clair ! 

[Liloo]

Je me permets de demander : si jamais les sites des restrictions entre lesquels on insère le plasmide génèrent des extrémités cohésives , il n'y a plus de question de compatibilité non ? Comme dans le QCM 12 du concours 2019 

[Violette1]

Il y a deux possibilités : 

- extrémités cohésives qui sont les mêmes entre le plasmide et le brin (des 2 cotés du plasmide et du brin), car les sites de restriction sont les mêmes, dans ce cas le brin peut s’insérer dans les deux sens dans le plasmide 

- extrémités cohésives qui ne sont pas les mêmes de chaque côté du plasmide et du brin mais qui sont les mêmes entre un côté du plasmide et un côté du brin et idem de l’autre côté : il faut alors regarder si le brin est orienté dans le bon sens ou non lorsqu’il s’insère, mais il n’a plus qu’une seule possibilité d’insertion 

 

je ne suis pas sure d’avoir très bien compris la question, dis moi si qqchose n’est pas clair @Liloo

Edited October 29, 2019 by Violette1

[Liloo]

Comme ça c'est clair mais je n'arrive pas à comprendre pourquoi la A et B sont juste dans le QCM.. 

[Cl02]

Il y a 10 heures, Violette1 a dit :

Salut ! 

 

Tout d'abord il faut que tu repères quels sites de restriction ont des extrémités compatibles.

 

Un brin pourra s'orienter au hasard dans 2 directions dans le plasmide. 

Si toutes les extrémités ne sont pas compatibles entre le plasmide et le brin, d'un sens ou de l'autre, alors il n'y a pas d'insertion du brin ds le plasmide.

Si les extrémités sont compatibles entre le plasmide et le brin, d'un sens ou de l'autre, alors le brin à 50% de chances de s'insérer dans le bon sens (vu qu'il s'insère au hasard donc 1 chance sur 2).

Enfin, si d'un coté c'est compatible et de l'autre non, il faut regarder si le brin est bien orienté de la même façon que le plasmide :

- si oui, le plasmide est orienté dans le bon sens 

- si non, il est orienté dans le mauvais sens

 

J'espère que c'est plus clair ! 

Oui merci beaucoup !

[Violette1]

@Liloo pour l'item A : on voit que SmaI et PmeI génèrent des bouts francs ou non cohésifs. Dans ce cas, pas besoin que les sites de restrictions génèrent des extrémités cohésives pour que le brin s'insère dans le plasmide 

Pour l'item B : les sites de restriction PuvI et SgfI génèrent des extrémités cohésives qui sont compatibles. Idem, le brin pourra donc s'insérer dans le plasmide.

 

As-tu bien compris la différence entre extrémités cohésives et non cohésives?

[Liloo]

Oui c'est bon j'ai compris , merci beaucoup ! 

[Wonder]

Le 30/10/2019 à 08:09, Violette1 a dit :

@Liloo pour l'item A : on voit que SmaI et PmeI génèrent des bouts francs ou non cohésifs. Dans ce cas, pas besoin que les sites de restrictions génèrent des extrémités cohésives pour que le brin s'insère dans le plasmide 

Pour l'item B : les sites de restriction PuvI et SgfI génèrent des extrémités cohésives qui sont compatibles. Idem, le brin pourra donc s'insérer dans le plasmide.

 

As-tu bien compris la différence entre extrémités cohésives et non cohésives?

Merci pour ta réponse, mais je ne comprends pas pourquoi dans plusieurs QCM on nous dit que les enzymes ne doivent pas être compatibles pour qu'un Fragment d'ADN puisse s'insérer dans un plasmide ? 

[Violette1]

Les enzymes ne doivent pas générer d’extrémités compatibles pour que le brin s’insère dans le bon sens dans le plasmide!

[Guest Enzymes]

Il y a 16 heures, Violette1 a dit :

Les enzymes ne doivent pas générer d’extrémités compatibles pour que le brin s’insère dans le bon sens dans le plasmide!

Ok merci, donc si j’ai bien compris si elles sont compatibles on vérifie l’ordre et si elles ne sont pas compatibles alors ça s’insérera forcément dans le bon sens ? 
parce que il y a des qcm qui nous demandent si on peut avec telle ou telle enzyme et c’est la ou je ne sais pas trop comment résoudre le problème. 

[mathltr]

Il y a 1 heure, Invité Enzymes a dit :

Ok merci, donc si j’ai bien compris si elles sont compatibles on vérifie l’ordre et si elles ne sont pas compatibles alors ça s’insérera forcément dans le bon sens ? 
parce que il y a des qcm qui nous demandent si on peut avec telle ou telle enzyme et c’est la ou je ne sais pas trop comment résoudre le problème. 

Salut  

je pense que t'as compris le truc, en gros il faut que tu regarde si l'extrémité 5' de ton ADNc est compatible avec l'extrémité qui suit l'origine de réplication sur ton plasmide. Si ces 2 la sont compatibles, ton insertion sera dans le bon sens. (il faut aussi que l'extrémité 3' de l'ADN soit compatible avec l'autre extrémité du plasmide bien sur).

 

Le piège, c'est si toutes les extrémités sont compatibles !! 

exemple : tu digère ton ADNc et ton plasmide seulement par EcoRI

Comme tu ne digères que pas une seule enzyme, on est d'accord que toutes les extrémités seront compatibles, donc ton ADN pourra s'insérer dans n'importe quel sens ! donc tu n'as qu'1/2 chance de bien exprimer ton ADN dans ton plasmide.... 

 

est ce que c'est clair ?