minuscortex Posted October 17, 2019 Posted October 17, 2019 Bonsoir, J'ai quelques petites questions concernant le dernier CCB : - QCM 6 : la correction détaillée du TAT nous indique (à juste titre ! ) qu'il faut chercher si les sites de restriction sont dans les amorces, que l'ordre / sens sont respectés pour un clonage bien orienté. Hors ce que me "dérange" c'est que ces sites sont certes sur l'amorce mais avant l'ATG donc avant une zone d'appariement avec l'ADN qu'on a copié, dans la région que j'indique sur mon dessin. Du coup je ne sais pas si ce morceau d'amorce fera vraiment parti du produit de PCR? https://photos.app.goo.gl/Av3DS3dhhfLpRCNd6 https://photos.app.goo.gl/PJFpQvwmeFg7bQyE8 - QCM 8 E : faux je me demandait si on était sur que ce soit de l'ADN DB, car avec tous les agents pour libérer l'ADN du début je me disais qu'il était peut-être dénaturé ? https://photos.app.goo.gl/N1uUaC3w3JAgEDpM8 - QCM 9C VRAI : là je me suis dit que la courbe n'était pas complètement à zéro donc que l'expression était faible mais pas nulle ? https://photos.app.goo.gl/u9fkWZZCvXDCCHmg6 merci par avance et bonne nuit !!! Quote
Solution AHMED24 Posted October 17, 2019 Solution Posted October 17, 2019 Salut ! Au cours de cette étape de PCR, on cherche à faire apparaître des sites de restriction pour pouvoir digérer le ADNc et l’intégrer dans le vecteur. Pour cela on fait apparaître dans les amorces les site de restrictions et c'est normal qu'ils soient en bout de chaîne pour que lors de la digestion être sûre d'avoir tout l'ADNc, depuis l'ATG initiateur jusqu'au codon stop et en plus c'est rare d'avoir une complémentarité des bases constituant le site de restriction et l'ADN qu'on cherche à amplifier. De plus sur ton schéma de la question 5, l'amorce n'est pas dans le bon sens : l'ADN polymérase synthétise de 5' en 3' donc elle lit le brin matrice de 3' en 5'. Pour le qcm 8, on ne travaille pas en milieu dénaturant. L'ampicilline est un antibiotique qui a permis de faire la sélection des bactéries contenant le vecteur recombinant. Et pour une précision, les bactéries issues de la même colonie sont tous pareil car elles proviennent du même bactérie qui s'est multiplié. Donc ici l'ADN est double brin, on pourra alors mesurer la DO. Pour la RT-PCR quantitative, dans le milieu il y'a un colorant qui s'intercale entre les 2 brins d'ADN donc seulement quand l'ADN est bicaténaire et devient fluorescent une fois intercalé. Donc cette méthode permet de retrouver la quantité en ADN au départ. Mais ici il y'a la notion de seuil, en dessous du seuil de détection de la fluorescence ( le trait horizontal ) on ne voit rien, donc on considère que la quantité de départ est très faible. voilà ! j'espère que ça t'a aider à mieux comprendre ! Quote
minuscortex Posted October 18, 2019 Author Posted October 18, 2019 Il y a 11 heures, AHMED24 a dit : Salut ! Au cours de cette étape de PCR, on cherche à faire apparaître des sites de restriction pour pouvoir digérer le ADNc et l’intégrer dans le vecteur. Pour cela on fait apparaître dans les amorces les site de restrictions et c'est normal qu'ils soient en bout de chaîne pour que lors de la digestion être sûre d'avoir tout l'ADNc, depuis l'ATG initiateur jusqu'au codon stop et en plus c'est rare d'avoir une complémentarité des bases constituant le site de restriction et l'ADN qu'on cherche à amplifier. De plus sur ton schéma de la question 5, l'amorce n'est pas dans le bon sens : l'ADN polymérase synthétise de 5' en 3' donc elle lit le brin matrice de 3' en 5'.! Merci beaucoup @AHMED24 ! tu as bien remarqué mon erreur : l'amorce 1 a la même séquence en base que le l'adn de base, et elle est dans le sens 5' 3' donc ce sera l'amorce sens, s'appariant sur le brin anti sens ! il vaut mieux bien le repérer maintenant Quote
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