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minuscortex
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Hello la purpanie ! 

 

J'ai un petit soucis sur la diapo 126, le marquage radioactif se ferait sur des dNTP et le marquage fluo sur des ddNTP.

 

En fait je ne comprends pas pourquoi le marquage RA (qui sont de petites molécules donc ne vont pas forcément interrompre la synthèse) se fait sur des dNTP puisque le but et de stopper la synthèse lors de l'incorporation d'un nucléotide marqué. Je pensais que c'était toujours sur des ddNTP ! 

 

vous avez compris ?

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Salut ! 

 

Le but de la méthode de Sanger est de détecter l'intégration d'un ddNTP, ce qui va provoquer un arrêt de l'élongation. 

 

Imagines que tu veux intégrer un ddATP. Si tu mets un fluorochrome (grosse molécule qui empêche la poursuite de l'élongation) sur les dNTP, ça va fausser ton résultat puisque ces derniers vont arrêter l'élongation précocement. 

 

Donc pour les dNTP on fait un marquage radioactif, qui ne gène pas l'élongation. 

 

Le ddATP lorsqu'il entre en jeu va bloquer l'élongation comme il est di-desoxy. Donc si tu le marques avec un fluorochrome, ça va certe bloquer mais c'est pas grave puisque c'est ce que tu cherches à faire ! 

 

 

Retiens qu'avec Sanger, arrêt de signal = intégration du ddNTP d'intérêt. 

 

Est-ce que c'est plus clair maintenant pour toi ?

Edited by anthonytro
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  • Solution

Si ! 

Tu peux faire un marquage radioactif des dNTP, pour détecter les brins de différentes tailles.

Comprends bien qu'avec ou sans marquage, quand le ddNTP s'insère l'élongation s'arrête.

 

Donc là ce qu'il faut comprendre c'est :

- Soit tu marques tes brins avec des désoxynucleotides radioactifs 

- Ou bien tu peux les marquer avec un fluorochrome sur le ddNTP en 3' ou en 5' au niveau de l'amorçe 

 

SURTOUT PAS de fluorochrome sur les dNTP sinon ça va fausser ton résultat, c'est surtout à cause de ça que le prof fait cette précision sur la diapo. 

 

Si tu ne comprend toujours pas pourquoi on peut utilise des dNTP radioactif je peux faire appel à un autre tuteur qui s'y prendra peut-être mieux pour t'expliquer, mais n'hésites surtout pas à le dire !! 😊

 

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@anthonytro J'ai compris ! enfin je crois ! 

 

si on fait un marquage RA, il faut alors bien savoir quel est le ddNTP qu'on a inséré, parce mettons qu'on détecte un brin de 9 bases RA, si on sait qu'on a mis du ddTTP on sait alors qu'on a une thymine en 9 

 

alors que si on met un fluo, comme on peut détecter la "couleur" de chaque ddNTP si on voit la couleur d'un T on sait qu'on aura un brin de n bases et donc un T en position n

 

c'est ça ?

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