génome chap 2 expérience retardement sur gel

[niveko]

bonjour , je n'ai pas compris l'objectif de l'expérience concernant le  retardement sur gel et la chromatographie d'affinité(diapo 58 59 du poly de salvayre) . A part montrer que l'adn se lie à la protéine je ne vois pas le but de ces 2 expériences.

Quelqu'un peut m'éclairer à ce sujet ?

[Liliputienne]

Bonjour ! 

Le retardement sur gel est utile pour savoir si une protéine se lie de façon spécifique ou non au DNA, chose que l’on peut vérifier avec un excès de compétiteur de même séquence ou non dans tous les cas non marqué et avec un Ac spécifique de la protéine en question  

 

 

[niveko]

Merci bcp pr ta réponse ! 

[luv94]

Bonjour!

Alors je vais tenter de te résumer un peu les techniques et leur intérêt. Dans les deux cas, tu cherches à savoir si une protéine d'intérêt interagit avec le fragment de DNA.

Dans la technique de retardement sur gel:

Ton fragment de DNA est marqué avec un composé fluorescent et donc sur le gel tu l'observera après migration sous forme d'une bande. 

Si lorsque tu ajoutes la protéine ton DNA migre moins loin, tu peux en conclure que ta protéine interagit bien avec ton DNA.

Maintenant tu cherches à savoir si cette interaction est spécifique. Pour cela tu vas rajouter sur ton gel un excès de DNA (la même séquence que celle que tu analyses depuis le début mais non marqué). Si l'interaction protéine-DNA est spécifique, les DNA non marqués vont se fixer à la protéine, et il restera donc moins de protéines à lier sur ton DNA marqué: de ce fait la bande retardée que tu observais sur ton gel sera plus petite. Pour être bien sûr que cela est spécifique à la séquence de DNA, tu peux encore faire une expérience dans laquelle tu rajoutes du DNA muté et non marqué en excès. Normalement si la liaison est spécifique le DNA muté ne pourra pas se lier à la protéine et tu auras donc toujours une bande retardée importante

Donc cette technique te permet d'analyser les interactions protéine et DNA, et de déterminer si ces interactions sont spécifiques ou non.

 

Dans la technique de chromatographie d'affinité tu observes seulement si ta protéine a ou non une affinité avec ton fragment de DNA. Le DNA est fixé sur des billes d'aggarose qui sont à l'intérieur de la colonne. Tu rajoutes alors un mélange de protéines à l'intérieur de la colonne. Si les protéines n'ont pas d'affinité pour le DNA, elles vont directement ressortir de la colonne. Tu récupères donc toutes les protéines non retenues, et tu passes ensuite un tampon d'élution. Il emportera avec lui la/les protéines qui se sont liées aux billes. Tu pourras ainsi conclure que ces protéines ont une affinité particulière pour telle zone de DNA. 

 

Voilà j'espère qu'en réexpliquant ces 2 techniques tu verras un peu plus leur intérêt, sinon n'hésite pas ^^ 

De mémoire il me semble que Salvayre ne pose quasi jamais de QCM sur ça au concours, il fait des choses plus simples mais bon pas d'impasses on ne sait jamais!

 

Bon courage :) 

 

[niveko]

Tout viens de d'éclaircir ! Merci bcp pour  cette réponse très  développée !

[luv94]

Il y a 11 heures, niveko a dit :

Tout viens de d'éclaircir ! Merci bcp pour  cette réponse très  développée !

Super, ravie d'avoir pu t'aider