VECTEURS TD

[DrR]

Salut y a plusieurs items qui m'ont posé pb dans le td 1 sur les vecteurs :

 

7 E : FAUX  est ce que c'est parce qu'il ne s'insère pas du tout ? étant donné que seules deux enzymes sont compatibles entre elles (Xhol et Sall) et Bglll et Xbal non compatibles.

 

18 C : mais si on digère l'insert par PSlt seulement, on peut pas obtenir l'insert non ? il a Pstl qu'à une extrémité ..

 

9 E : je vois pas comment l'hybridation permet de voir si l'arnm n'est pas dégradé ? qu'est ce que ça rapporte comme info en plus ? le nombre de paire de bases ?

 

 

13 A : pourquoi "n'importe quel type cellulaire", si c'est un type cellulaire qui n'a pas le gène G ?

 

 

4C : est ce que c'est faux parce que le plasmide n'a pas de site xhol malgré que xhol et sall soient compatibles ?

 

15 E ; je comprends l'explication mais ça me tracasse prc de ce que j'ai compris du S1, la taille qu'on voit c'est ce qui a pu s'hybrider avec la sonde donc pourquoi elle serait plus petite que ce qu'on voit ?

20 A : ducoup je me demande, si c'était un northen blot on aurait pas de signal si j'ai bien compris ?

 

 

Merci à ceux qui auront le courage de lire tous ces qcm  

 

 

 

 

 

 

[Sakamain]

Coucouuu

 

alors on a pas ça en recherche nous maiss notre cher Langin () nous a bassiné avec ça au S1 donc je me lance :

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

7 E : FAUX  est ce que c'est parce qu'il ne s'insère pas du tout ? étant donné que seules deux enzymes sont compatibles entre elles (Xhol et Sall) et Bglll et Xbal non compatibles.

je suis d'accord avec le fait que il ne pourra pas s'insérer, par contre pour moi c'est XhoL et Sall qui ne sont pas compatibles et BgIII et XbaI qui sont compatibles (si tu regardes la complémentarité il ne faut pas oublier qu'on est sur du double brin)

 

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

18 C : mais si on digère l'insert par PSlt seulement, on peut pas obtenir l'insert non ? il a Pstl qu'à une extrémité ..

Si tu digères par PSlt tu auras une extrémité avec le bout 5' de la seq coupée par Pslt et l'autre bout la suite par exemple si Pslt coupe comme ça : 5' CCA/AG3' tu auras au bout 5'xxxxCCA //coupure// AGxxxx3' et du coup pas de soucis si on veut l'insérer dans un plasmide lui aussi digéré par PSlt

(je sais pas si c'est très bien expliqué, mais en gros quand tu casses un élastique par exemple #rip tu n'as qu'une seule coupure et pourtant tu as bien deux bouts.. maitenant si tu casses un deuxième élastique au même endroit et de la même manière tu pourrais en sois recoller les deux et former un giga élastique.. tu vois ?)

 

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

9 E : je vois pas comment l'hybridation permet de voir si l'arnm n'est pas dégradé ? qu'est ce que ça rapporte comme info en plus ? le nombre de paire de bases ?

je passe

 

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

13 A : pourquoi "n'importe quel type cellulaire", si c'est un type cellulaire qui n'a pas le gène G ?

tous nos gènes sont dans l'adn de chacune de nos cellules, ce qui va changer c'est si ils sont exprimés (et donc production d'ARNm correspondants) ou pas.. après là je trouve que c'est tordu pcq ils te parlent de transcription illégitime (qui permet donc l'expression du gène alors qu'il devrait pas être exprimé et donc la fabrication de l'ARNm du gène G nécessaire à la RT-PCR) donc je sais pas si c'est un truc spécial rangueil mais jtrouve ça grave piégeux, dis moi si c'est clair

 

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

4C : est ce que c'est faux parce que le plasmide n'a pas de site xhol malgré que xhol et sall soient compatibles ?

ui puisqu'on te dit seulement ECOR1 et xhoI

 

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

15 E ; je comprends l'explication mais ça me tracasse prc de ce que j'ai compris du S1, la taille qu'on voit c'est ce qui a pu s'hybrider avec la sonde donc pourquoi elle serait plus petite que ce qu'on voit ?

je sais pas trop ce qu'on vous dit à rangueil, mais en tout cas ce que j'ai retenu c'est que la sonde te permet de détecter, c'est genre le petit panneau "coucou on est là", après tout ce que tu observes c'est dû à l'ARNm en lui même

 

Il y a 9 heures, Docteurmrb a dit :

20 A : ducoup je me demande, si c'était un northen blot on aurait pas de signal si j'ai bien compris ?

je passe

 

Voilà voilà, dis moi si c'est clair et bon courage !!

(du coup il reste la 9E et la 20A)

 

Edited April 25, 2019 by Cachka

[DrR]

merci beaucoup d'avoir répondu !! j'ai compris j'attends de voir si quelqu'un sait pour le reste

[Bilskur]

Bonjour

On va reprendre tout ça  

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

7 E : FAUX  est ce que c'est parce qu'il ne s'insère pas du tout ? étant donné que seules deux enzymes sont compatibles entre elles (Xhol et Sall) et Bglll et Xbal non compatibles.

 

Je suis d'accord avec toi, c'est bien parce que pour pouvoir s'insérer, il faut que ça colle aux deux extrémités  

Le 25/04/2019 à 00:29, Cachka a dit :

c'est XhoL et Sall qui ne sont pas compatibles et BgIII et XbaI qui sont compatibles (si tu regardes la complémentarité il ne faut pas oublier qu'on est sur du double brin)

Non! C'est bien ce qu'avais mis @Docteurmrb qui est juste, BgIII et XbaI ne sont pas compatibles. 

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

18 C : mais si on digère l'insert par PSlt seulement, on peut pas obtenir l'insert non ? il a Pstl qu'à une extrémité ..

 

Le cDNA a deux sites de coupures pour PstI, et le vecteur a un site de clivage. 

Donc tu peux ouvrir le vecteur, et générer deux extrémités de type PstI, et comme tu peux préparer ton cDNA en générant aussi deux extrémités de ce type là, tu pourras tout à fait l'insérer. Par contre, il faudra traiter ton vecteur par de la phosphatase alcaline pour ne pas qu'il se referme vu que ses deux extrémités collent, et ton cDNA pourra s'insérer dans les deux sens. 

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

9 E : je vois pas comment l'hybridation permet de voir si l'arnm n'est pas dégradé ? qu'est ce que ça rapporte comme info en plus ? le nombre de paire de bases ?

 

Alors, la sonde va se lier à son ARN complémentaire, donc ça permet de vérifier sa présence si tu marques a sonde  

Et ça permet de faire un "contrôle" sur tout ton ARN, pour vérifier que tes résultats sont bien liés à une particularité de l'ARN étudié et non à une erreur de manipulation (surtout dans le cas de ton sujet 3). Est-ce qu'il n'a pas cet ARN là parce que c'est une anomalie, ou parce qu'on s'est loupé dans la manip et que tout a été dégradé et ça fause tout? 

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

13 A : pourquoi "n'importe quel type cellulaire", si c'est un type cellulaire qui n'a pas le gène G ?

 

On te parle de transcription "illegitime" dans la correction. Ca veut dire que même si ton gène G n'est pas exprimé partout, il fait partie de ton génome, donc tous les types de cellules de ton organismes le possèdent, lais ne l'expriment pas forcément. 

Mais par contre, il est possible que tu aies des cellules qui l'expriment mais en toutes petites quantité, donc ça ne fait rien à ta cellule, et il y a très peu de protéines qui en ressortent, mais ces ARN existent quand même et la RT-PCR permet, grace à l'amplification, de les faire ressortir. 

Et du coup tu peux en théorie tout retrouver, dont ton gène G, dans tout type cellulaire donné  

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

4C : est ce que c'est faux parce que le plasmide n'a pas de site xhol malgré que xhol et sall soient compatibles ?

 

Oui, si tu ne peux pas ouvrir ton plasmide avec les enzymes proposées, on s'en moque de la compatibilité, vu que de toute façon ça pourra rien intégrer du coup. 

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

15 E ; je comprends l'explication mais ça me tracasse prc de ce que j'ai compris du S1, la taille qu'on voit c'est ce qui a pu s'hybrider avec la sonde donc pourquoi elle serait plus petite que ce qu'on voit ?

 

Je suis pas sur, mais je pense qu'ils utilisent une même ribosonde pour tout, et du coup ils "étalonnent" avec  

Ils ne la prennent pas en compte, parce que c'est la même partout, et que ce qui les intéresse c'est la taille de ce qui s'y apparie  

 

Le 25/04/2019 à 00:01, Docteurmrb a dit :

20 A : ducoup je me demande, si c'était un northen blot on aurait pas de signal si j'ai bien compris ?

 

Oui, même si ton gène est KO, il peut quand même être présent dans le génome mais muté. En revanche, KO veut dire qu'il ne sera pas transcrit, donc pas d'ARN, donc rien sur le Northern

 

Voilà, j'espère que c'est clair  

[DrR]

Le 27/04/2019 à 11:29, Bilskur a dit :

Bonjour

On va reprendre tout ça  

 

Je suis d'accord avec toi, c'est bien parce que pour pouvoir s'insérer, il faut que ça colle aux deux extrémités  

Non! C'est bien ce qu'avais mis @Docteurmrb qui est juste, BgIII et XbaI ne sont pas compatibles. 

 

Le cDNA a deux sites de coupures pour PstI, et le vecteur a un site de clivage. 

Donc tu peux ouvrir le vecteur, et générer deux extrémités de type PstI, et comme tu peux préparer ton cDNA en générant aussi deux extrémités de ce type là, tu pourras tout à fait l'insérer. Par contre, il faudra traiter ton vecteur par de la phosphatase alcaline pour ne pas qu'il se referme vu que ses deux extrémités collent, et ton cDNA pourra s'insérer dans les deux sens. 

 

Alors, la sonde va se lier à son ARN complémentaire, donc ça permet de vérifier sa présence si tu marques a sonde  

Et ça permet de faire un "contrôle" sur tout ton ARN, pour vérifier que tes résultats sont bien liés à une particularité de l'ARN étudié et non à une erreur de manipulation (surtout dans le cas de ton sujet 3). Est-ce qu'il n'a pas cet ARN là parce que c'est une anomalie, ou parce qu'on s'est loupé dans la manip et que tout a été dégradé et ça fause tout? 

 

On te parle de transcription "illegitime" dans la correction. Ca veut dire que même si ton gène G n'est pas exprimé partout, il fait partie de ton génome, donc tous les types de cellules de ton organismes le possèdent, lais ne l'expriment pas forcément. 

Mais par contre, il est possible que tu aies des cellules qui l'expriment mais en toutes petites quantité, donc ça ne fait rien à ta cellule, et il y a très peu de protéines qui en ressortent, mais ces ARN existent quand même et la RT-PCR permet, grace à l'amplification, de les faire ressortir. 

Et du coup tu peux en théorie tout retrouver, dont ton gène G, dans tout type cellulaire donné  

 

Oui, si tu ne peux pas ouvrir ton plasmide avec les enzymes proposées, on s'en moque de la compatibilité, vu que de toute façon ça pourra rien intégrer du coup. 

 

Je suis pas sur, mais je pense qu'ils utilisent une même ribosonde pour tout, et du coup ils "étalonnent" avec  

Ils ne la prennent pas en compte, parce que c'est la même partout, et que ce qui les intéresse c'est la taille de ce qui s'y apparie  

 

Oui, même si ton gène est KO, il peut quand même être présent dans le génome mais muté. En revanche, KO veut dire qu'il ne sera pas transcrit, donc pas d'ARN, donc rien sur le Northern

 

Voilà, j'espère que c'est clair  

Merci beaucoup c'est parfait comme explications !!!