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Méthodes d'étude des protéines


LauLAbricot
Go to solution Solved by NicoLqe,

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Bonjour,

J'ai besoin d'explications sur des notions à propos des charges et pI des protéines. Je suis consciente que ces notions datent du premier semestre et il se trouve que je n'ai jamais pris la peine de vraiment y prêter attention. 

Bref, je me demandais tout d'abord en quoi le pI des protéines a un rapport avec le pH?

Du coup, est-ce qu'un un pI d'une protéine négatif s'accorde avec un pH plutôt alcalin et vice-versa?

Parce qu'en fait, j'ai noté que par exemple si le pI de la protéine est inférieur au pH de travail, elle s'accroche à la colonne. Donc s'il y a un pH élevé sur la colonne il y a aussi des charges positives pour que les protéines négatives s'accrochent, et donc un pH assez haut (alcalin) est synonyme de charges positives?

J'espère être assez claire dans mes propres et que quelqu'un saura m'éclairer, un grand merci d'avance ? 

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  • Solution

Coucou !

On va faire un petit point sur la charge de la protéine en fonction de son pI par rapport au pH du milieu d'abord, après je te ferai un petit récap sur les chromato d'échange d'anions puis de cations.

Le pI d'une prot, c'est comme le pHi d'un acide aminé au 1er semestre : c'est le pH auquel la protéine va avoir une forme neutre (zwitterion) c'est-à-dire, sans charges + ni charges -. C'est pour ça que le pI a un rapport avec le pH du milieu dans lequel tu es. En fonction du pH du milieu, la prot sera soit chargée +, soit neutre, soit chargée -.

Petit rappel : dans une protéine, ce sont les groupements ionisables qui vont faire bouger la charge de la protéine par leur capacité à accepter/rejeter un proton.

Quand tu es à pH faible (acide), tu as beaucoup de protons dans le milieu ok ? Vu que toutes tes toutes tes fonctions ionisables sont entourées d'énormément de protons, elles auront tendance à en capter le plus possible : elles adopteront leur forme la plus protonée possible, donc elles seront positives ou neutres (selon le groupement ionisable dont on parle : si c'est une fonction NH2, elle sera NH3+, si c'est une fonction COO-, elle sera COOH).

Quand tu es à pH élevé (basique), c'est l'inverse : très peu de protons dans le milieu, donc les fonctions ionisables vont relarguer leurs protons dans le milieu, elles auront tendance à être négatives (pour les COOH par exemple), ou neutres (pour les NH2 par exemple).

 

Maintenant que tu as captée ça :

Pour une chromato d'échange d'anions : comme son nom l'indique tu vas trier les anions (donc les prot qui ont tendance à porter plus de charges négatives que positives). Ton support sera donc des billes de sépharose (ou cellulose peu importe) couplées à des groupements positifs : en l'occurence diéthyl-amino-ethyl.

Au départ, pour que toutes les protéines s'accrochent au support +, tu vas te mettre à pH basique (8 ou 9, ça paraît pas mal) de manière à ce que tous les pI des protéines soient inférieurs au pH du milieu, les groupements ionisables adoptent leur forme la moins protonée possible : donc tes protéines auront une charge globale négative. Les protéines qui s'accrochent pas sont positives, donc avec un pI supérieur au pH du milieu, elles sont donc toutes éluées directement. Ton milieu aura également une faible force ionique : peu de Na+ Cl- dans le milieu de manière à ce que les seules interactions ioniques soient entre le support et les protéines (faudrait pas que une protéine négative s'accroche à du Na+ et soit éluée directement au lieu de s'accrocher au support...). Plus le pI d'une protéine est faible, plus l'interaction avec le support sera forte et difficile à dissocier.

Puis, tu vas vouloir décrocher tes protéines une à une. Tu vas donc réaliser un gradient de NaCl : tu vas augmenter la force ionique petit à petit, ce qui va déstabiliser la liaison ionique d'une prot sur le support : en rajoutant peu de NaCl, tu vas réussir à décrocher les liaisons qui étaient vraiment faibles, les protéines éluées possèdent un pI vraiment proche du pH du milieu donc l'interaction est facile à détruire, puis plus tu vas rajouter du NaCl, plus tu vas décrocher des protéines avec un pI faible car leurs liaisons ioniques étaient plus fortes.

In fine tu vas donc faire une élution des pI décroissante.

 

 

Pour une chromato d'échange de cations : cette fois tu tries des protéines +, donc ton support est chargé -. Même principe qu'avant : tu te mets à faible force ionique, et cette fois ci à pH faible pour avoir le plus de protéines possibles qui s'accrochent : càd le le plus de protéines avec un pI supérieur au pH du milieu (pour être chargé +). Celles qui tombent tout de suite ont un pI inférieur au pH du milieu, donc elles sont encore négatives et elles s'accrochent pas. ^^

Cette fois ci pour réaliser ton élution, tu fais un gradient de pH : tu augmentes le pH petit à petit, comme ça chaque fois que le pH du milieu va dépasser le pI d'une protéine, la protéine en question passe de chargée + à chargée -, et donc elle tombe.

In fine, tu fais donc une élution des pI croissante cette fois, les pI les plus faibles tombent en premier, les plus élevés en dernier.

 

 

Voilà ! N'hésite surtout pas si y'a autre chose, sinon j'espère que tu as compris :p 

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