clem66 Posted September 19, 2018 Share Posted September 19, 2018 Bonjour, je n'ai pas compris le fonctionnement et l'utilité de la technique de retardement sur gel ou EMSA, est-ce que quelqu'un pourrait me l'expliquer rapidement ? merciiii Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Micasaestucasa Posted September 19, 2018 Share Posted September 19, 2018 Salut, d'après ce que j'ai compris c'est à la base une électrophorèse où les fragments d'adn vont migrer sur le gel dans un courant électrique selon leur taille. Donc si une protéine est fixée à une séquence d'adn le fragment correspondant migrera moins loin qu'un fragment d'adn seul (car il sera plus gros) ce qui va se traduire par une bande de retardement , ça permettrait donc de savoir sur quelle séquence se fixe une protéine Enfin voilà ce que j'ai compris je sais pas si c'était clair ahah, peut être que quelqu'un d'autre pourra mieux l'expliquer et plus en détails! Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
clem66 Posted September 20, 2018 Author Share Posted September 20, 2018 Il y a 18 heures, Mikasa a dit : Salut, d'après ce que j'ai compris c'est à la base une électrophorèse où les fragments d'adn vont migrer sur le gel dans un courant électrique selon leur taille. Donc si une protéine est fixée à une séquence d'adn le fragment correspondant migrera moins loin qu'un fragment d'adn seul (car il sera plus gros) ce qui va se traduire par une bande de retardement , ça permettrait donc de savoir sur quelle séquence se fixe une protéine Enfin voilà ce que j'ai compris je sais pas si c'était clair ahah, peut être que quelqu'un d'autre pourra mieux l'expliquer et plus en détails! Ok c’est beaucoup plus clair merci beaucoup!! Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
Porthos Posted September 20, 2018 Share Posted September 20, 2018 Salut clem ! Je vais moi aussi tenter de t'expliquer cette méthode en esperant apporter un petit plus. La méthode de retardement sur gel permet d'identifier certaines interactions DNA-protéine. Comme l'explique très bien Mikasa, le DNA marqué migre plus ou moins loin en fonction de si il est associé à un autre élément ou non. Ensuite, les 3ème et 4ème bandes permettent d'identifier si cette réaction est spécifique ou non. En effet dans un premier temps on remarque que en utilisant un oligo-bidule spécifique non marqué en excès la bande du haut est plus fine : cela veut dire que le DNA marqué migre seul en majorité bien que quelques uns ont tout de même interagit avec la protéine (cf la ptite bande) Quand on utilise du oligo-bidule non spécifique alors rien ne change --> bingo ça veut dire que la protéine a une affinité spécifique avec le DNA marqué La dernière expérience sert a à peu près la même chose, l'AC étant spécifique à la protéine, si il y a un retardement encore plus grand ça veut dire qu'on a identifié quelle est la protéine qui se fixe a DNA marqué ! Bisous bisous Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
PacesCoinFlip Posted September 20, 2018 Share Posted September 20, 2018 Hola On imagine que l’on cherche à montrer qu’une protéine particulière peut interagir avec une séquence donnée. On utilise la technique de retardement sur gel/EMSA. (suis les numéros avec les bandes du schéma) (1) On prend un oligonucléotide de séquence bien définie. On le fait migrer à l’électrophorèse; on a un nucléotide fluorescent bi caténaire marqué. (2) On y fait réagir la protéine (dont on pense que c’est un facteur de transcription) et on fait l’électrophorèse. On voit apparaître une seconde bande retardée par rapport à la 1ère. Il y a eu une interaction entre la protéine et l’oligonucléotide, et donc la formation d’un complexe, qui est donc retardé. (3) On rajoute des oligonucléotides spécifiques non marqués, qui sont des compétiteurs spécifiques du nucléotide de départ (c’est-à-dire qu’ils ont la même séquence). Mais on en met 10 fois plus. On ajoute aussi la protéine. On remarque que la bande retardée est atténuée. Le complexe formé précédemment est atténué à cause des oligonucléotides non marqués spécifiques qui rentrent en compétition car ils ont été mis en excès. (4) On refait la même chose mais avec des oligonucléotides non spécifiques non marqués. On en met toujours en excès. Cette fois ci il n’y a pas d’interaction entre cet oligonucléotide non spécifique et la protéine. C’est pourquoi la bande retardée n’est plus atténuée. /!\ Si il y avait une diminution de la bande retardée, cela voudrait dire que l’interaction nucléotide marqué/protéine est non spécifique, car même un oligonucléotide non spécifique aurait rompu cet interaction. On voit donc ici une spécificité entre notre nucléotide marqué et la protéine. (5) On peut aussi utiliser un anticorps spécifique à la protéine. On vérifie si cet anticorps s’y accroche bien, et ne s’accroche pas à un isofacteur (protéines différentes qui reconnaîtraient la même séquence de l’oligonucléotide marqué). Le complexe formé permet l’identification du facteur spécifique. La bande est encore plus retardée à cause de l’anticorps. Kiss Quote Link to comment Share on other sites More sharing options...
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