QCM 9 Partie 5

[Jules66]

Bonjour, est ce que quelqu'un peut m'expliquer les items B et CDE, merci d'avance!

[etou]

Bonjour Jules ! 

On sait que le plasmide est coupé au niveau de EcoRI pour permettre l'insertion de l'ADNc.
De plus, on voit que l'ADNc a un site de restriction EcoRI côté 5' et côté 3'.
Pour ces raisons, on peut conclure que l'orientation de l'ADNc se fait

• à 50% dans la bonne orientation
• à 50% dans la mauvaise orientation

 

On voit, sur le schéma du plasmide, que le site EcoRI est situé entre l'ATG et le codon STOP du gène de la beta galactosidase (lac z). (Je t'ai joint un schéma pour comprendre cette partie)

• Si l'ADNc ne s'est pas inséré dans le site EcoRI : expression normale du gène de la beta galactosidase
  lorsqu'on ajoutera Xgal, les colonies seront donc bleues
   
• Si l'ADNc s'est inséré dans le site EcoRI : on a le promoteur P/O, puis l'expression de la protéine démarre au niveau de l'ATG du gène de la galactosidase. Ensuite, on a la transcription du début du gène de la galactosidase, puis survient l'ADNc inséré. On a donc transcription du début de l'ADNc inséré à la suite de la transcription du gène de la beta galactosidase. On arrive alors au codon stop de l'ADNc ! on a la formation de protéine de fusion : 
  - avec une partie Nterm qui correspond à la transcription du début du gène de la beta galactosidase
  - et une partie Cterm qui correspond à la transcription de notre ADNc inséré (c'est la bonne séquence si celui ci s'est inséré dans le bon sens, et une mauvaise séquence si l'ADNc s'est inséré dans le mauvais sens. Dans tous les cas, on n'aura pas la protéine de la beta galactosidase en entier).
  Le gène de la beta galactosidase n'est donc pas transcrite en entier, donc même en rajoutant Xgal, les colonies seront blanches. 

On voit sur le schéma de la boîte de Pétri de droite, les plasmides dits "recombinants" : les plasmides dits recombinants ont inséré l'ADNc dans le bon ou le mauvais sens. Dans tous les cas, la protéine de la beta galactosidase n'est pas produite en entier.

Pourtant, on voit que certains continuent de coder pour la beta galactosidase (points noirs). Donc l'insertion de l'ADNc (que ce soit dans le bon ou le mauvais sens) ne s'est pas fait correctement.

 Item A VRAI

 

 

Quelle est alors la différence entre les colonies II et III?

Elles ont toutes les deux inséré l'ADNc puisque les colonies restent blanches.

 

On prélève alors les colonies et on les digère par BamHI. Après électrophorèse sur gel d'agarose, on voit les résultats que tu vois sur la figure du sujet. Comment expliquer ces différences?

 

Les sites BamHI existants sont : 

• Sur le plasmide, juste avant le promoteur/opérateur du gène de la beta galactosidase.
• Sur l'ADNc, au milieu de la séquence.

On va donc distinguer les trois cas possibles : (De nouveau, je t'ai joint un schéma pour comprendre cette partie)

• L'ADNc ne s'est pas inséré (colonies bleues, donc colonies I) : On a juste le site BamHI provenant du plasmide : c'est pour ça qu'après électrophorèse sur gel d'agarose, on voit une seule bande d'un poids très très lourd
• L'ADNc s'est inséré dans le bon sens (colonies blanches) : On a donc les deux sites BamHI, celui du plasmide et celui de l'ADNc. Or, entre BamHI du plasmide et EcoRI (début de l'ADNc), on a 400pb. Le site BamHI arrive assez tôt dans la séquence de l'ADNc : il y a coupure ici.
• L'ADNc s'est inséré dans le mauvais sens (colonies blanches) : On a donc les deux sites BamHI, celui du plasmide et celui de l'ADNc. Pareil, entre le BamHI du plasmide et EcoRI (début de l'ADNc, qui correspond au côté 3' en fait, car il est dans le mauvais sens), on a 400pb. Le site BamHI arrive tard dans la séquence de l'ADNc, puisque l'ADN c est inséré dans le mauvais sens. Il y a coupure ici

Dans le cas où l'ADNc s'est inséré correctement, on a donc obtention de deux fragments : 

• Le long fragment qui correspond au reste du plasmide (sans l'ADNc), toujours détecté en haut poids moléculaire en haut de la figure
• Le fragment contenant l'ADNc : ce fragment est plus long dans le cas où l'ADNc s'est inséré dans le mauvais sens, puisque le site BamHI arrive plus tard, comparé au fragment dans le cas où l'ADNc s'est inséré dans le bon sens (le site BamHI arrive tôt)

On peut donc en déduire que la colonie II est celle où l'ADNc s'est insérée dans le bon sens (fragment de 600pb), et que la colonie III est celle où l'ADNc s'est insérée dans le mauvais sens (fragment de 1000pb).

 

On peut donc en conclure que :

• La longueur du fragment de la colonie II est de 600 pb :
  sachant qu'entre BamHI du plasmide et EcoRI (début de l'ADNc), on a 400pb, on sait qu'entre EcoRI (début de l'ADNc), et BamHI de l'ADNc (inséré dans le bon sens), on a 600-400 = 200pb.
• La longueur du fragment de la colonie III est de 1000 pb :
  sachant qu'entre BamHI du plasmide et EcoRI (début de l'ADNc inséré dans le mauvais sens), on a 400pb, on sait qu'entre EcoRI (début de l'ADNc inséré dans le mauvais sens), et BamHI de l'ADNc (inséré dans le mauvais sens), on a 1000-400 = 600pb.

On peut donc en déduire qu'entre EcoRI (début de l'ADNc inséré dans le bon sens) et EcoRI (début de l'ADNc inséré dans le mauvais sens, autrement dit la fin de l'ADNc inséré dans le bon sens), on a :

200 + 600 = 800pb.     C'est donc la taille de l'ADNc.

 

 Item B VRAI

 

Dans le cas où l'ADNc est inséré dans le mauvais sens, la protéine ne sera pas du tout le même que celle codée dans le cas où l'ADNc est inséré dans le bon sens. 

 Item C FAUX, item E FAUX

 

Sachant que les colonies II ont leur ADNc inséré dans le bon sens,

 Item D VRAI

 

 

 

J'espère t'avoir aidé, et n'hésite pas si tu ne comprends pas quelque chose ! 

[Jules66]

Merci infiniment pour cette réponse