lubellule Posted October 1, 2016 Share Posted October 1, 2016 Bonjour, pour réaliser une sonde marquée faut-il toujours utiliser la méthode d'amorçage au hasard et utiliser de l'alpha 32P dCTP ? Car il me semble que monsieur Langin a évoqué la création de sondes marquées uniquement lors de sa présentation du random priming, cependant les sondes peuvent également être des désoxynucléotides non ?... et donc pourraient être marqués à la polynucléotide kinase. Merci pour votre aide ! A bientôt Link to comment Share on other sites More sharing options...
Chloe-M Posted October 2, 2016 Share Posted October 2, 2016 Salut! Alors oui, je pense que les sondes peuvent être marquées à la polynucléotide kinase. Cependant, il a clairement dit que cette méthode donnait quelque chose de très peu radioactif, et avec une activité spécifique faible comparé à la méthode du random priming. Je pense que c'est plus dans un soucis pratique qu'il n'a pas évoqué la notion de "sonde" en parlant de la méthode à la polynucléotide kinase! Link to comment Share on other sites More sharing options...
Solution Gwendoline_sabat Posted October 2, 2016 Solution Share Posted October 2, 2016 Bonsoir ! La méthode d'amorçage au hasard (qui utilise bien toujours de l'alpha32P dCTP) permet d'obtenir une quantité de radioactivité importante par rapport à la taille de la molécule étant donné que la processivité du fragment de Klenow est d'environ 400 bases, une fois les 400 bases synthétisées, le fragment se décroche et de nouvelles amorces se fixent, permettant au final d'obtenir des morceaux de 400 bases couvrant la totalité du fragment à synthétiser.Ainsi, le random priming permet de radiomarquer de longues sondes. La méthode de marquage d'oligodésoxynucléotide à la polynucléotide kinase, quant à elle, ne permet qu'un marquage radioactif terminal, de fait, la molécule est peu radioactive.Ainsi, théoriquement, radiomarquer une sonde avec la polynucléotide kinase est possible si la sonde que tu souhaites marquer est petite. Autrement, la sensibilité de détection sera insuffisante et tu ne verras rien sur ton autoradiographie par exemple. J'espère que c'est clair, n'hésitez pas à demander plus de précisions si c'est toujours flou ! Link to comment Share on other sites More sharing options...
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