orientation plasmide

[Aya]

bonsoir !

Qq'un peux m'expliquer comment orienter le segment dans les 2 sens après le ttt avec lez enzymes dans le 2ème plasmide ?

j'ai vrmt du mal a calculer le nombre de base . 

je sais que le ATG dois être côté promoteur mais je n'arrive pas a comprendre comment ça marche  

merci 

Edited February 18, 2024 by Aya

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Aya, tu as un exemple pour que je t’explique ? 

[Aya]

salut !  @Cassolnousmanque2

 

voilà !

 

 TAT Astuces - Vecteurs et Plasmides-.pdf

[Cassolnousmanque2]

@AyaAh oui j’avais corrigé ce qcm l’an dernier (ce sont mes corrections que tu trouves sur la fiche du tat) 

En gros ça fonctionne comme si tu calculais une distance entre 2 points en maths 

Par exemple quand tu veux calculer la taille d’un fragment situé entre HindIII à 3400 pb et HindIII à 1620 pb, tu fais 3400 - 1620 = 1780 pb

La méthode est la même que si tu faisais une randonnée et que tu calculais la distance entre ton point de départ situé au km 1620 et ton point d’arrivée situé au km 3400. Là tu aurais aussi fait 3400 - 1620 et tu aurais trouvé que la distance qui sépare ta position de ton point d’arrivée est de 1780 km. 

C’est pas plus compliqué que ça 

 

Pour orienter l’insert, là il y a 2 sens parce que c’est un clonage non orienté avec 2 BamH1. SI on avait utilisé deux EdR différentes et non compatibles, on aurait fait un clonage orienté et donc la flèche correspondant au promoteur n’aurait pu s’insérer que dans un seul sens !

 

Le truc par rapport à l’ATG ça se base déjà sur le fait que ton plasmide est double brin même si classiquement on en dessine qu’un à chaque fois. Donc admettons que ton ATG soit sur le brin extérieur de ton plasmide, et que ton promoteur ait la flèche qui pointe vers l’ATG, il est donc du même coté que l’ATG donc la transcription va pouvoir avoir lieu et la traduction aussi. 

Par contre, si tu insères ton promoteur dans l’autre sens (la flèche ne pointe pas vers l’ATG), alors ton promoteur sera sur l’autre brin, donc ton gène d’intérêt ne pourra pas s’exprimer. 

 

Ça va mieux ?

Edited February 18, 2024 by Cassolnousmanque2

[C'estPASSimple]

il y a 2 minutes, Cassolnousmanque2 a dit :

Ah oui j’avais corrigé ce qcm l’an dernier (ce sont mes corrections que tu trouves sur la fiche du tat) 

En gros ça fonctionne comme si tu calculais une distance entre 2 points en maths 

Par exemple quand tu veux calculer la taille d’un fragment situé entre HindIII à 3400 pb et HindIII à 1620 pb, tu fais 3400 - 1620 = 1780

La méthode est la même que si tu calculais la distance entre ton point de départ situé au km 1620 et ton point d’arrivé situé au km 3400. Là tu aurais aussi fait 3400 - 1620 et tu aurais trouvé que la distance qui sépare ta position de ton point d’arrivée est de 1780 km. 

C’est pas plus compliqué que ça 

 

Pour orienter l’insert, là il y a 2 sens parce que c’est un clonage non orienté avec 2 BamH1. SI on avait utilisé deux EdR différentes et non compatibles, on aurait fait un clonage orienté et donc la flèche correspondant au promoteur n’aurait pu s’insérer que dans un seul sens !

Bonsoir, j'ai une question qui n'a rien a voir avec ce qcm en particulier mais j'avais un doute concernant le choix des enzymes de restriction, est-ce qu'ils faut qu'elles soient tt les deux presentes dans les deux plasmides obligatoirement ou est-ce que par ex on pourrait utiliser Bam et Eco dans le pProm (on imagine qu'il y a un adn que l'un veut recup entre les deux) et ensuite l'inserer dans le promoteur receveur, sachant qu'il n'a qu'un seul site Bam et non pas de site Eco ? Jsp si c'est clair mais en gros est-ce que si on utilise les enzymes Bam et Eco il faut obligatoirement la presence des deux sur le plasmides ou on insert ou est-ce que bam suffit ? 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @C'estPASSimple, il faut effectivement que les sites de restriction des deux EdR soient présentes sur le plasmide donneur et sur le plasmide receveur. (Dans des cas extrêmement rares, si les EdR sont compatibles, on peut réaliser un clonage avec des EdR qui n’ont pas de site sur le plasmide receveur alors qu’il y a des sites sur le plasmide donneur par exemple, mais ce sont des cas très précis et plus ou moins hors programme pour l’année de PASS donc ne retiens pas ça !)

Edited February 18, 2024 by Cassolnousmanque2

[Aya]

@Cassolnousmanque2 D'acc je comprends ça

mais sił n'y a pas de sequence ATG present comme c'est le cas ici , qu'est ce que je fais ?

https://ibb.co/TT1q0Yr

 

 

[Cassolnousmanque2]

@Aya, il y a un ATG ici sur l’ADNc codant la beta globine si tu regardes bien !

Edited February 18, 2024 by Cassolnousmanque2

[Aya]

@Cassolnousmanque2 oui mais c'est sur le plasmide donneur , c'est le même cas donc ?

[Cassolnousmanque2]

@AyaOui oui puisque tu vas récupérer le fragment qui contient l’ATG

 

Ce qui est important c’est qu’il soit présent sur le plasmide recombinant final que tu obtiens !

Edited February 19, 2024 by Cassolnousmanque2

[Aya]

@Cassolnousmanque2  

 

Je suis désolé de te déranger, mais j'ai des autre questions   (c'était dans le dernier colle ) 
- item B est marqué vrai , mais le 2ème plasmide ne contient pas une partie du génome qui donne la resistance à la génémicine, (comme  je ne prendrai que la partie du gène de

l'insulin )

-item C est marqué faux en disant :Cela n'est pas possible car l'ADNc de l'insuline est entouré d'un site de Xho 1 à 950 et de Eco R1 à 2900, il y aura donc un clonage orienté qui aboutira à un plasmide recombinant de 5500 pb.

Mais si je coupe autour de Ecori1 (300) et Xho1 (3300) le gène de l'insuline sera toujours inclus, alors pourquoi est-ce faux ?

 

aussi ici il n'ya pas ATG dans les 2 plasmides donc comment je l'oriente ?

 

https://ibb.co/pbBF2k5

 

merci bcp pour ton aide 

[Cassolnousmanque2]

@Aya, 

Alors pour le B on te parle de pABC tel qu’il est dessiné sur dans l’énoncé. On n’apporte donc pas de modification à ce plasmide avant de l’insérer dans des cellules procaryotes. 

Tu remarques que le gène de résistance à la généticine est sous le contrôle d’un promoteur procaryote, donc effectivement on pourra sélectionner les cellules procaryotes transformées par pABC (donc l’item B est vrai).

 

Pour le C, si tu coupes par EcoR1 et Xho1 le pABC, tu auras 4 fragments : 

- 1er fragment entre EcoR1 (300 pb) et Xho1 (950 pb)

- 2e fragment entre Xho1 (950 pb) et EcoR1 (2900 pb)

- 3e fragment entre Xho1 (3300 pb) et EcoR1 (2900 pb)

- 4e fragment entre Xho1 (3300 pb) et EcoR1 (300 pb)

=> donc tu ne peux pas récupérer le fragment entier entre EcoR1 (300) et Xho1 (3300) qui contient l’ADNc codant pour l’insuline. 

 

Alors effectivement il n’y a pas d’ATG de mentionné sur les plasmides. Après habituellement on part du principe que le gène a son ATG dans le sens de la pointe de la flèche du plasmide initial (ou donneur si tu préfères), donc ici l’ATG serait du coté de Xho1 (950 pb) et pas du coté du terminateur. Après à l’examen ils mettront sûrement l’ATG pour que tout soit vraiment clair mais s’ils ne le font pas, au moins tu sauras comment l’interpréter avec ce que je viens de te dire 

 

Est-ce que c’est plus clair ? N’hésite pas si tu as d’autres questions ;)

Edited February 19, 2024 by Cassolnousmanque2

[Aya]

@Cassolnousmanque2

Les enzymes coupent-elles d'une manière spécifique dans un plasmide donnée ? Je pensais qu'elles coupaient de manière aléatoire.

donc on peut obtenir bcp plus que trois fragment comme aussi :

 Ecori ( 300 ) and xho ( 3300 )
 ecori (300 ) and Xho1 (950)
xho1 ( 950 ) et Ecori (2900 )
ecori ( 300 ) Ecori (2900)

Xho1 (950 ) et xho1 (3300 )
 

Si je coupe et obtiens le gros fragment (entre 300 et 3300 qui contient aussi l'insulin ), sera-t-il coupé forcement en plus petits fragments ?

[Cassolnousmanque2]

Elles coupent au niveau de chaque site de restriction. 

Et oui j’avais zappé le site à 2900 pb (la fatigue me guette), je viens de modifier ma réponse au-dessus

Par contre on ne va pas pouvoir récupérer ces deux fragments : 

il y a 31 minutes, Aya a dit :

ecori ( 300 ) Ecori (2900)

Xho1 (950 ) et xho1 (3300 )

En utilisant à la fois EcoR1 et Xho1. Si on veut les récupérer il faudrait utiliser 1 seule EdR à chaque fois 

il y a une heure, Aya a dit :

-item C est marqué faux en disant :Cela n'est pas possible car l'ADNc de l'insuline est entouré d'un site de Xho 1 à 950 et de Eco R1 à 2900, il y aura donc un clonage orienté qui aboutira à un plasmide recombinant de 5500 pb.

Pour ce qui est des calculs, en coupant avec EcoR1 et Xho1 dans pDEF, on va éliminer la séquence comprise entre les deux sites de restriction (donc on enlève 250 pb car 550 - 300 = 250)

 

Dans pABC on va couper à 950 pb et à 2900 pb pour récupérer l’ADNc codant pour l’insuline -> le fragment fera donc 2900 - 950 = 1950 pb 

 

Donc le plasmide recombinant va faire : 3800 - 250 + 1950 = 5500 pb

Edited February 19, 2024 by Cassolnousmanque2

[Aya]

@Cassolnousmanque2

 dac merci bcp pour ton aide 

[Cassolnousmanque2]

Avec plaisir ;)