techniques d’étude de l’ADN

[sarahferiel]

Bonjour,

alors en fait j’ai du mal à comprendre cette partie du cours enfin particulièrement dans les qcm le principe et ce type d’exercices genre comment on utilise BAMH1 pourquoi on a tel nombre,

si quelqu’un peut mieux m’éclairer afin de mieux comprendre ce serait sympa

merci d’avance

( c’est un exemple du sujet de l’an dernier j’ai bien compris le qcm 1 mais le 2 et 3 je rame 

 

Indiquez les propositions exactes et inexactes pour les QCMs suivants :

Les QCMs 1 à 4 traitent du même sujet

QCM1.

Des cliniciens veulent induire une réponse antitumorale chez un patient. Ils vont donc modifier génétiquement des mélanocytes malins in vivo (injection d'un plasmide directement à un patient afin de sur-exprimer un antigène particulier appelé MART. Pour cela, ils utiliseront un plasmide où l'ADNc codant MARI, sera sous la dépendance d'un promoteur tissu-spécifique, permettant l'expression de MART dans les mélanocytes.

 

QCM2.

La construction plasmidique pour exprimer MART a été réalisée de la façon suivante : les plasmides A et B (représentés ci-dessous) ont été digérés par BamH1, puis le plasmide A digéré a été traité par la phosphatase alcaline, Le fragment de 600 pb (fragment C) correspondant au promoteur tissu

spécifique a été purifié. Une ligation du plasmide A digéré et traité par la phosphatase, avec le fragment C a été ensuite réalisée. Pour finir, des bactéries compétentes ont été transformées par le produit de ligation. ( plasmides en pièce jointe )

1. Il s'agit d'un clonage orienté.
2. Après ligation et compte tenu que la phosphatase alcaline n'est pas très performante nous obtenons 4 types de plasmides différents.
3. Les mélanocytes humains pourraient sur-exprimer MART si on les transfectait avec le plasmide
   A même sans promoteur tissu-spécifique.
4. Quel que soit le sens d'insertion du fragment C dans le plasmide A l'ADNc MART s'exprimera car le sens d'insertion d'un promoteur importe peu.
5. La transformation de bactéries compétentes par le produit de ligation sert à obtenir des lignées de bactéries comprenant chacune un seul type de plasmide.

 

QCM3.

Après transformation les bactéries résistantes à l'ampicilline ont été sélectionnées. L'ADN plasmidique a été extrait de 3 clones différents. Ils ont été digérés par Hindill seule, BamH1 seule ou BamH1 et Hindill ensemble. Le produit des digestions enzymatiques a été analysé sur gel d'électrophorèse après migration et coloration des fragments au SYBR green. Le schéma du gel d'électrophorèse est présenté ci-dessous. ( pièce jointe ) 

• A. La digestion par BamH1 permet d'identifier si nous sommes en présence d'un plasmide recombinant (plasmide A ayant intégré le fragment C) ou non recombinant (Plasmide A).
• B. La digestion par Hindill permet d'identifier si nous sommes en présence d'un plasmide
  recombinant ou non recombinant.
• C. La double digestion Hindill et BamH1 permet d'identifier le sens d'insertion du fragment
• D- Le plasmide 1 sera utilisé pour les transfections ultérieures
• E-Une digestion par Xhol aurait permis d'identifier les plasmides recombinant des plasmides non recombinants 

 

 

IMG_0557.pdf IMG_0558.pdf

[orthosympathique]

salut @sarahferiel, peux tu me donner la correction de la prof stp?

[sarahferiel]

oui évidemment le voici ;)

https://zupimages.net/viewer.php?id=24/03/8cq0.png

[orthosympathique]

super merci @sarahferiel

je vais essayer de t'expliquer la résolution des deux qcm le plus détaillé possible! 

qcm2 

A : déjà un clonage orienté c'est quand le fragment que tu insères se met dans une position bien précise. le 5' d'un côté et le 3' de l'autre. ici tu ouvres ton plasmide avc bamH1. plus c'est une enzyme qui coupe à bords francs. Donc ton insert peut se mettre dans un sens ou dans l'autre pour lui c'est pareil. le clonage est donc non orienté. = item faux.

B : ici en gros tu mets dans un tube ton vecteur vide, ton enzyme pour l'ouvrir, ce que tu veux insérer et une enzyme pour ligaturer. Il peut se passer plusieurs choses: soit le vecteur peut se refermer avant d'avoir reçu un insert donc tu obtiens un plasmide vide. Soit un insert vient s'y insérer. Attention on est dans un clonage non orienté donc l'insert peut s'insérer dans le "bon" sens = ATG à coté du promoteur ou dans le mauvais. Ce qui te fais 3 types de vecteurs et non 4. ici tu insert le promoteur, il doit être dans le sens où sa fin doit être au début de l'adnc de ton gène d'intérêt. 

C. Si tu n'as pas de promoteur, l'ADN ne sera pas transcrit puis traduit donc impossible

D. Là on revient à ce qu'on disait dans les autres items, l'ATG de l'adnc doit être du côté du promoteur mais du côté de la fin dr promoteur. Si tu commences promoteur - codon stop il ne va rien se passer. Donc c'est faux

E. vrai

 

QCM 3 

A : première info on te parle bamH1 sur le plasmide A donc on regarde le plasmide A et on voit qu'il est juste avant la sq de MART. Il n'est présent qu'une fois. Ton plasmide A fait 6000 pb. ton fragment C fait 600 pb. Si C est inséré dans A le total sera de 6600pb. En digérant par bamH1 tu ouvres juste le plasmide à cet endroit là. le site est composé de deux parties identiques qui vont être coupées. tu vas donc avoir deux bouts représentants le plasmide A à 6000pb et l'insert à 600pb. L'item est donc vrai

B. idem que pour la question d'avant juste au lieu de couper à bamh1 tu coupes à HindlII. et le HindlII est présent sur le promoteur donc tu vas avoir un fragment en plus si tu digères par HindlII en fonction de la présence ou non du promoteur

C. le sens d'insertion du fragment tu peux le connaître seulement si tu essayes d'obtenir la protéine MART. c'est le sens qui va déterminer la capacité à produire la protéine. on ne peut pas le voir en coupant le plasmide car dans un sens ou l'autre, le fragment fait la même taille. 

D. Pour cet item la correction donnée est simple as tu compris ? as tu besoin de re explication

E. idem que la D

 

j'espère que c'est clair, si tu as besoin n'hésites pas !

[sarahferiel]

merci beaucoup j’hésiterai pas :))