célesteee Posted January 10 Posted January 10 bonjour :) c'est un peu con mais j'arrive pas à comprendre pourquoi le fait que le promoteur soit intégré dans le bon ou le mauvais sens ça change quelque chose (par exemple dans la fiche astuce du tat, dans le qcm 1 item C)? est-ce que qqun peut m'expliquer svp ? merci! Quote
Ancien Responsable Matière Solution Lulu_le_Fou Posted January 10 Ancien Responsable Matière Solution Posted January 10 Il y a 2 heures, célesteee a dit : bonjour :) c'est un peu con mais j'arrive pas à comprendre pourquoi le fait que le promoteur soit intégré dans le bon ou le mauvais sens ça change quelque chose (par exemple dans la fiche astuce du tat, dans le qcm 1 item C)? est-ce que qqun peut m'expliquer svp ? merci! Salut En voyant la fiche plasmide, je vois ce que tu veux dire, c'est à dire tu te demande pourquoi selon le sens du promoteur, les fragments coupés seront différents quand tu coupes par Pst 1 En effet, selon le sens du promoteur, les sites de clivage des enzymes de restriction ne vont pas se situer pareil les uns des autres En effet, dans ce cas, si le promoteur est dans le bon sens (c'est à dire la flèche enface de la séquence d'intéret) : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/03/hjq8.jpeg Alors la distance entre les deux sites de Pst 1 sera de 150 (50 entre BAM H1 et Pst 1, ainsi que 100 entre Pst 1 (celui de l'insert) et BAM H1) donc 2 FRAGMENTS En effet, dans ce cas, si le promoteur est dans le mauvais sens (c'est à dire la flèche PAS EN FACE de la séquence d'intéret) : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/03/hjq8.jpeg Ici la distance entre les deux sites de Pst 1 sera différente et beaucoup plus grande (750) Voilà mais après il fallait pas forcément calculer les tailles pour répondre à l'item mais juste remarquer qu'il y a 2 sites de clivages de Pst 1 et donc 2 fragments NOMBRE DE FRAGMENTS = NOMBRE DE SITE DE CLIVAGE DE L'ENZYME EN QUESTION Pour conclure, le sens du promoteur va jouer un rôle dans les distances entre les sites de clivage et les modifier par la suite ( Je sais pas du tout si je suis clair, je te conseille de voir la correction de l'item C et des explications qui suivent (tu pourras revoir ça dans la fiche c'est un copier collé) Bisouss C. Le plasmide recombinant obtenu coupé par Pst1 libère un unique fragment de 6000 paires de bases (pb). FAUX Si le promoteur n’est pas intégré, on obtiendra 1 fragment de 5200 pb. Si le promoteur est intégré dans le bon sens, on obtiendra 2 fragments de 150 et 5850 pb. Si le promoteur est intégré dans le mauvais sens, on obtiendra 2 fragments de 750 et 5250 pb. Version détaillée : Alors déjà dans un premier temps je te conseille de dessiner le (ou les) plasmide(s) recombinant(s) que tu obtiens à la fin. Ici on coupe les vecteurs (étape de digestion) par une seule enzyme de restriction qui est BamH1. On réalise donc un clonage non orienté. Voici les deux plasmides qu’on obtient après insertion de la séquence de pPROM dans pLUMI : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/03/hjq8.jpeg (peut-être refaire les plasmides au propre) Maintenant on va faire différents calculs avant de répondre à la question posée : Taille de l’insert = distance entre BamH1 et BamH1 = 1600 - 800 = 800 pb Taille du plasmide recombinant = 5200 + 800 = 6000 pb Maintenant on calcule la nouvelle position des différents sites de restriction pour les enzymes de restriction dans pLUMI (1) : - Distance entre HindIII et BamH1 (1) dans pPROM = 810 - 800 = 10 pb => on ajoutera + 10 pb à la position de BamH1 (1) dans pLUMI recombinant - Distance entre EcoR1 et BamH1 (1) dans pPROM = 820 - 800 = 20 pb => on ajoutera + 20 pb à la position de BamH1 (1) dans pLUMI recombinant - Distance entre Xho1 et BamH1 (1) dans pPROM = 830 - 800 = 30 pb => on ajoutera + 30 pb à la position de BamH1 (1) dans pLUMI recombinant - Distance entre HindIII et BamH1 (1) dans pPROM = 1120 - 800 = 320 pb => on ajoutera + 320 pb à la position de BamH1 (1) dans pLUMI recombinant - Distance entre Pst1 et BamH1 (1) dans pPROM = 1500 - 800 = 700 pb => on ajoutera + 700 pb à la position de BamH1 (1) dans pLUMI recombinant - Distance entre BamH1 (2) et BamH1 (1) dans pPROM = taille de l'insert = 800 pb Ceci étant fait, on calcule donc les nouvelles positions : BamH1 est situé à 1300 pb dans pLUMI donc : Nouvelle position de HindIII = 1300 + 10 = 1310 pb Nouvelle position de EcoR1 = 1300 + 20 = 1320 pb Nouvelle position de Xho = 1300 + 30 = 1330 pb Nouvelle position de HindIII = 1300 + 320 = 1620 pb Nouvelle position de Pst1 = 1300 + 700 = 2000 pb Nouvelle position de BamH1 (2) = 1300 + 800 = 2100 pb Maintenant on fait pareil pour les autres sites de restriction qui étaient déjà présents sur pLUMI non recombinant - Distance entre Pst1 et BamH1 (2) dans pLUMI = 1350 - 1300 = 50 pb => on ajoutera + 50 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant pour avoir la nouvelle position de Pst1. - Distance entre HindIII et BamH1 (2) dans pLUMI = 2600 - 1300 = 1300 pb => on ajoutera + 1300 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant pour avoir la nouvelle position de HindIII. Donc on obtient : Nouvelle position de Pst1 = 2100 + 50 = 2150 pb Nouvelle position de HindIII = 2100 + 1300 = 3400 pb Maintenant qu'on a toutes les positions des sites de restriction sur le plasmide recombinant (la position de HindIIII à 1200 pb et de Xho1 à 1000 pb ne changeant pas puisque l'insert se fait après), on va pouvoir calculer les tailles des fragments qu'on obtient après digestion par Pst1 comme on te le demande dans l'item C 1er fragment : Distance entre Pst1 (1) et Pst1 (2) = 2150 - 2000 = 150 pb 2e fragment : Distance entre Pst1 (2) et Pst1 (1) dans l'autre sens = 6000 - 150 = 5850 pb -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Maintenant on calcule la nouvelle position des différents sites de restriction pour les enzymes de restriction dans pLUMI (2): - Distance entre HindIII et BamH1 (2) dans pPROM = 1600 - 810 = 790 pb => on ajoutera + 10 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant - Distance entre EcoR1 et BamH1 (2) dans pPROM = 1600 - 820 = 780 pb => on ajoutera + 20 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant - Distance entre Xho1 et BamH1 (2) dans pPROM = 1600 - 830 = 770 pb => on ajoutera + 30 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant - Distance entre HindIII et BamH1 (2) dans pPROM = 1600 - 1120 = 480 pb => on ajoutera + 480 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant - Distance entre Pst1 et BamH1 (2) dans pPROM = 1600 - 1500 = 100 pb => on ajoutera + 100 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant - Distance entre BamH1 (2) et BamH1 (1) dans pPROM = taille de l'insert = 800 pb (en gros c'est exactement les mêmes calculs que dans la partie précédente mais à l'envers) Ceci étant fait, on calcule donc les nouvelles positions : BamH1 (2) est situé à 1300 pb dans pLUMI donc : Nouvelle position de HindIII = 1300 + 790 = 2090 pb Nouvelle position de EcoR1 = 1300 + 780 = 2080 pb Nouvelle position de Xho = 1300 + 770 = 2070 pb Nouvelle position de HindIII = 1300 + 480 = 1780 pb Nouvelle position de Pst1 = 1300 + 100 = 1400 pb Nouvelle position de BamH1 (1) = 1300 + 800 = 2100 pb Maintenant on fait pareil pour les autres sites de restriction qui étaient déjà présents sur pLUMI non recombinant - Distance entre Pst1 et BamH1 (2) dans pLUMI = 1350 - 1300 = 50 pb => on ajoutera + 50 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant pour avoir la nouvelle position de Pst1. - Distance entre HindIII et BamH1 (2) dans pLUMI = 2600 - 1300 = 1300 pb => on ajoutera + 1300 pb à la position de BamH1 (2) dans pLUMI recombinant pour avoir la nouvelle position de HindIII. Donc on obtient : Nouvelle position de Pst1 = 2100 + 50 = 2150 pb Nouvelle position de HindIII = 2100 + 1300 = 3400 pb (donc ça c'est exactement les mêmes calculs que pour la première partie) Maintenant qu'on a toutes les positions des sites de restriction sur le plasmide recombinant (la position de HindIIII à 1200 pb et de Xho1 à 1000 pb ne changeant pas puisque l'insert se fait après), on va pouvoir calculer les tailles des fragments qu'on obtient après digestion par Pst1 comme on te le demande dans l'item C 1er fragment : Distance entre Pst1 (1) et Pst1 (2) = 2150 - 1400 = 750 pb 2e fragment : Distance entre Pst1 (2) et Pst1 (1) dans l'autre sens = 6000 - 750 = 5250 pb Donc peu importe qu'on parle du pLUMI (1) ou du pLUMI (2), on aura 2 fragments et non pas un seul -> item C faux Vector 1 Quote
célesteee Posted January 11 Author Posted January 11 Il y a 14 heures, Lulu_le_Fou a dit : Salut En voyant la fiche plasmide, je vois ce que tu veux dire, c'est à dire tu te demande pourquoi selon le sens du promoteur, les fragments coupés seront différents quand tu coupes par Pst 1 En effet, selon le sens du promoteur, les sites de clivage des enzymes de restriction ne vont pas se situer pareil les uns des autres En effet, dans ce cas, si le promoteur est dans le bon sens (c'est à dire la flèche enface de la séquence d'intéret) : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/03/hjq8.jpeg Alors la distance entre les deux sites de Pst 1 sera de 150 (50 entre BAM H1 et Pst 1, ainsi que 100 entre Pst 1 (celui de l'insert) et BAM H1) donc 2 FRAGMENTS En effet, dans ce cas, si le promoteur est dans le mauvais sens (c'est à dire la flèche PAS EN FACE de la séquence d'intéret) : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/03/hjq8.jpeg Ici la distance entre les deux sites de Pst 1 sera différente et beaucoup plus grande (750) super merci beaucoup!! Quote
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