RT PCR

[mathi.asparagine]

Bonsoir ! J'ai oublié de poser une question hier à la permanence, en fait j'ai pas du tout compris cette diapo et les explications du prof sur la RT PCR...

Est ce que quelqu'un peut m'expliquer svp ? 

Edited March 15, 2024 by mathi.asparagine

[emmacrophage]

coucou !! @mathi.asparagine alors les produits qu'on a obtenu après notre PCR vont pouvoir être analysés soit après PCR sur gel d'électrophorèse soit en cours de PCR quantitative (aussi appelée PCR en temps réel) donc c'est ce qui va nous intéresser ici . Il va y avoir incorporation d'un agent fluorescent (par exemple le SYBR green) qui va s'intercaler dans l'ADN double brin au niveau du petit sillon. D'abord, on va dénaturer l'ADN, il n'y aura aucune fluorescence mais par la suite, quand on polymérise l'ADN avec notre ADN polymérase, il va y avoir émission de fluorescence. On va donc analyser les produits PCR obtenus en cours de synthèse (différents cycles de PCR) par mesure de la fluorescence émise et on obtient un graphique tel que celui du diaporama par exemple. 

 

j'espère que c'est plus clair pour toi :) n'hésite pas si tu as des questions !

 

[mathi.asparagine]

Ok juste pour vérifier si j'ai bien compris je réexplique : en gros on a fait une PCR donc on à choisi spécifiquement une partie de l'ADN. Quand il est dénaturé, il n'y a pas de petit sillon et le fluorophore SYBR green ne peut donc pas s'intercaler mais quand on repolymérise l'ADN avec une ADN polymérase, le petit sillon va "réapparaître" entre les deux brins et le fluorochrome se fixe. Et donc à chaque fois on dénature et on réplique et la fluorescence va augmenter ?

Est ce que c'est ça ? 

Mais du coup quel est le rapport avec les ARN qu'on a extrait :

Edited March 15, 2024 by mathi.asparagine

[_Alice_]

Coucou,

il me semble que tu as bien compris le principe de la PCR quantitative ! Après dénaturation, la polymérisation permet à l'agent intercalant (SYBR green) de se fixer dans le sillon de l'ADN et ce phénomène de fixation génère une émission de fluorescence. Cette fluorescence est le reflet de l'amplification de l'ADN, elle est proportionnelle à la quantité d'ADN double brin produite par cycle de PCR. (L'objectif de la PCR est justement celui d'amplifier une séquence nucléotique).

Voici un ancien post dans lequel la méthode de la PCR est encore un peu plus détaillée (si tu veux en savoir plus) :

 

La PCR quantitative peut être combinée avec la RT-PCR quantitative ; cette technique te permet de détecter la présence d'ARNm en temps réel par le phénomène de transcription inverse en ADNc (Reverse Transcription). Les ARNm utilisés sont issus d'ARN totaux qui ont pu être obtenus grâce à la méthode d'extraction de l'ARN ! Autrement dit, les ARN totaux que tu as extrais en suivant le protocole contiennent de l'ARNm que tu peux récupérer par chromatographie d'affinité. L'ARNm recueilli peut ensuite être utilisé pour réaliser la RT-PCR quantitative (qui associe réaction de reverse transcription avec la PCR quantitative).

 

  Je ne sais pas si ces explications répondent à ta question, n'hésite pas si besoin. Plein de courage !

[mathi.asparagine]

Merci beaucoup !! Tout est plus clair grâce a toi