PACES doublants QCM4

[PetiteComète]

Bonjour, est-ce qu'il serait possible de m'expliquer en détails le QCM4 de l'annale 2020 PACES doublants s'il vous plait car je n'ai pas tout compris au document présenté ce qui est quand même un peu problèmatique car même si c'est que des QCMs et donc qu'on ait guidé avec les items  j'aimerais vraiment le comprend pour pouvoir le refaire sans problème et la correction ne m'aide pas beaucoup.

 

Je vous joint le sujet p198 : https://tutoweb.org/PDFs/Librairie/PASS/Annales PACES actualisées/S2/Recherche/S2 - PASS - Recherche - Compilation d'annales.pdf#[{"num"%3A1091%2C"gen"%3A0}%2C{"name"%3A"XYZ"}%2C56.7%2C785.189%2C0]

[Cassolnousmanque2]

Coucou @PetiteComète,

j’ai corrigé ce qcm ici : https://forum.tutoweb.org/topic/89812-technique-pharma-1/#comment-478790

Si jamais tu as besoin d’autres précisions tu me dis 

 

Bon courage ;)

 

[PetiteComète]

Coucou @Cassolnousmanque2, tout d'abord merci pour ta réponse, j'ai notamment lu celle du sujet https://forum.tutoweb.org/topic/89660-qcm-4-annales-paces-doublants-2020-21/#comment-477169 qui est très bien expliquée mais je t'avoue que je ne comprends quand même pas...

 

Je m'explique d'abords par rapport au document en tant que tel :

 

On a un genre de tableau où on nous met le poid moléculaire des différents fragments retrouvé pour chaque clone et selon chaque site de digestion et ça je le vois mais comment on sait en fonction de ça si ils sont dans le bon sens ??

 

2 questions principales  :

 

1°Je comprends pas comment on insère notre ensemble "promoteur-flX-terminat" avec P et avec N (ma questions est peut-être débile car peut-être qu'on a déjà notre plasmqide recombiné et qu'ensuite on fait agir les enzymes mais je ne suis pas sûre)

-Pour P : on ne peut pas le couper dans pflX (P y est présent qu'une seule fois)

-Pour N : on ne peux pas le couper du tout donc comment il est présent dans pAAV8 ??

 

2°On sait que B et P ne sont présent qu'une seule fois dans le plasmide pAAV8 tandis que N est présent deux fois.

Or quelques soit le clone que l'on regarde on se retrouve parfois avec des fragments qui ne sont pas logique.

Par exmple pour le clone 1 digéré par N : pourquoi on a qu'un quel fragement alors que N est présent deux fois ??? On devrait en avoir deux, non ?

Une fois intégré dans le plasmide notre ensemble  "promoteur-flX-terminat" avec BamH1, on aura deux sites BamH1 ce qui peut expliquer la présence de deux bandes dans chacun des clones lors de la digestion de ce dernier par B.

Si on part de ce principe là, en intégrant dans le plasmide notre ensemble  "promoteur-flX-terminat" par BamH1, on ajoute un site P ce qui explique ça présence en double dans les clones 1 et 3 mais pourquoi pas dans le clone 2 ??

 

Pour ce qui est de N qui a qu'uen seule bande je me dis que peut-etre l'autre fragement n'est pas reconnu car non porteur du plasmide mais pourtant on fait simplement un gel d'electrophorèse donc on est pas sensé tout récupérer, non ?

 

 

Ensuite pour ce qui est des items :

 

A (vraie) : j'aurais dit que oui car si il a bien était intégré on aura deux fragent ce qui est le cas pour les clones 1 et 3 : c'est ça ??

 

B(vraie): pour moi : si on a 1 seul site P on peut determiner sa taille directement  et si la transfection a marché on fait la somme de nos deux fragements mais ici ça marche pas car par exmeple pour le clone 3 dans la colonne P (mes valeurs sont approximatives) : 5800 + 600 = 6400 or le clone 1 nous dit : 5000 + 1200 donc on a pas la même chose...

 

C(faux): On nous parle d'amorces A et B mais d'ou viennent ces amorces ? Comment elles font concrètement pour nous dire si la séquence est présentes ou non?

 

D(vraie): là je suis complètement perdue, je ne vois pas comment P peut nous indiquer le sens d'insertion...

 

E(faux): pareils que pour la D

 

Bref, je suis encore un peu perdu, je t'ai écrit là tous mes doutes et mes réfléxions donc c'est un peu brouillon, j'èspère que tu comprendra ce que j'ai voulu dire et que tu pourras y répondre...

[Cassolnousmanque2]

il y a 47 minutes, PetiteComète a dit :

1°Je comprends pas comment on insère notre ensemble "promoteur-flX-terminat" avec P et avec N (ma questions est peut-être débile car peut-être qu'on a déjà notre plasmqide recombiné et qu'ensuite on fait agir les enzymes mais je ne suis pas sûre)

Dans l’énoncé du qcm 3 on te dit que tu obtiens le plasmide recombinant par digestion enzymatique avec BamH1 donc je ne comprends pas de quoi tu parles avec Pst1 et Nco1 est-ce que tu pourrais reformuler ta question s’il te plait ? 

Si tu parles du fait que tu retrouves des digestions enzymatiques avec Nco1, BamH1 et Pst1 sur le gel d’électrophorèse du qcm 4, on ne clone pas de fragment, on part directement du plasmide recombinant (donc soit avec l’insert dans le bon sens, soit avec l’insert dans le mauvais sens, cf les schémas que j’ai mis dans l’autre post que tu as vu) et on fait des digestions

 

Petit rappel : 

- une digestion c’est le fait de couper le plasmide au niveau de sites de restriction -> on obtient des fragments 

- un clonage c’est le fait de faire une digestion, de récupérer les fragments et de faire une libation pour les mettre à un autre endroit -> on obtient un plasmide recombinant 

 

il y a 55 minutes, PetiteComète a dit :

-Pour P : on ne peut pas le couper dans pflX (P y est présent qu'une seule fois)

-Pour N : on ne peux pas le couper du tout donc comment il est présent dans pAAV8 ??

Donc avec Pst1, on va couper au niveau de tous les sites Pst1 dans les trois clones (donc au niveau de 2 sites pour les clones recombinants) et au niveau de 1 seul site pour le clone qui correspond au plasmide initial non recombinant) 

 

Avec Nco1 tu coupes au niveau de 1 seul site peu importe le clone 

 

 

il y a une heure, PetiteComète a dit :

Par exmple pour le clone 1 digéré par N : pourquoi on a qu'un quel fragement alors que N est présent deux fois ??? On devrait en avoir deux, non ?

Tu as un seul site Nco1 dans les plasmides, (attention à ne pas confondre avec Not1) donc tu vas simplement linéariser le plasmide 

il y a une heure, PetiteComète a dit :

Si on part de ce principe là, en intégrant dans le plasmide notre ensemble  "promoteur-flX-terminat" par BamH1, on ajoute un site P ce qui explique ça présence en double dans les clones 1 et 3 mais pourquoi pas dans le clone 2 ??

Dans le clone 2 tu as le plasmide non recombinant donc tu as un seul site Pst1 puisque celui qui est contenu dans l’insert n’est pas intégré dans le plasmide puisqu’on ne met pas d’insert

il y a une heure, PetiteComète a dit :

Pour ce qui est de N qui a qu'uen seule bande je me dis que peut-etre l'autre fragement n'est pas reconnu car non porteur du plasmide mais pourtant on fait simplement un gel d'electrophorèse donc on est pas sensé tout récupérer, non ?

Je ne vois pas bien ce que tu veux dire… 

il y a une heure, PetiteComète a dit :

A (vraie) : j'aurais dit que oui car si il a bien était intégré on aura deux fragent ce qui est le cas pour les clones 1 et 3 : c'est ça ??

Oui c’est ça 

en fonction de la taille des fragments tu sauras si tu as un insert ou non

[Cassolnousmanque2]

il y a une heure, PetiteComète a dit :

B(vraie): pour moi : si on a 1 seul site P on peut determiner sa taille directement  et si la transfection a marché on fait la somme de nos deux fragements mais ici ça marche pas car par exmeple pour le clone 3 dans la colonne P (mes valeurs sont approximatives) : 5800 + 600 = 6400 or le clone 1 nous dit : 5000 + 1200 donc on a pas la même chose...

Si tu as un seul site, tu pourras juste linéariser le plasmide, donc effectivement, ce que tu dis (qu’avec un seul site ça pourrait fonctionner) est vrai pour les cas où l’insert n’a pas la même taille que le fragment que tu enlèves dans le plasmide quand tu coupes au niveau de 2 sites de restriction

 

 

il y a une heure, PetiteComète a dit :

C(faux): On nous parle d'amorces A et B mais d'ou viennent ces amorces ? Comment elles font concrètement pour nous dire si la séquence est présentes ou non?

Tu les vois dans l’énoncé commun aux qcm 1, 2, 3, 4 sur le plasmide pAAV8

elles amplifient la séquence donc tu sauras combien de nucléotides elle fait mais ce n’est pas un séquençage donc tu ne connais pas la position de chaque nucléotide, ce qui fait que tu ne peux pas savoir où sont les sites de restriction pour Pst1

il y a une heure, PetiteComète a dit :

D(vraie): là je suis complètement perdue, je ne vois pas comment P peut nous indiquer le sens d'insertion...

Pst1 n’est pas situé au milieu de l’insert donc selon le sens d’insertion, il sera plus ou moins proche de l’autre site Pst1

il y a une heure, PetiteComète a dit :

E(faux): pareils que pour la D

Pour que tu aies une expression de ton gène d’intérêt (donc transcription + traduction), il faut que le promoteur soit dirigé vers la séquence à transcrire 

Sinon, ça veut dire que tu transcriras le brin qui ne possède pas d’ORF (cadre de lecture = ATG ————— STOP) donc la traduction sera impossible 

Or ici tu as l’enchaînement promoteur - séquence génique dans l’insert donc peu importe le sens d’insertion, cet enchaînement sera toujours respecté 

 

Voilà en espérant avoir pu t’aider 

[PetiteComète]

Merci beaucoup @Cassolnousmanque2 pour tes réponses !

 

il y a une heure, Cassolnousmanque2 a dit :

Dans l’énoncé du qcm 3 on te dit que tu obtiens le plasmide recombinant par digestion enzymatique avec BamH1 donc je ne comprends pas de quoi tu parles avec Pst1 et Nco1 est-ce que tu pourrais reformuler ta question s’il te plait ?

Ok, je n'avais pas compris qu'on reprenait le plsmide recombiné du qcm3 : merciii

 

il y a 53 minutes, Cassolnousmanque2 a dit :

Si tu as un seul site, tu pourras juste linéariser le plasmide, donc effectivement, ce que tu dis (qu’avec un seul site ça pourrait fonctionner) est vrai pour les cas où l’insert n’a pas la même taille que le fragment que tu enlèves dans le plasmide quand tu coupes au niveau de 2 sites de restriction

Je ne comprends pas ce que tu as écrit en gras (or c'est certainement le plus important...), tu peux le reformuler s'il te plaît ?

Tu veux bien me rappeler ce qu'est un "insert" ?

[Cassolnousmanque2]

il y a 20 minutes, PetiteComète a dit :

Je ne comprends pas ce que tu as écrit en gras (or c'est certainement le plus important...), tu peux le reformuler s'il te plaît ?

Tu veux bien me rappeler ce qu'est un "insert" ?

Admettons que je prenne un plasmide de 2,3 kpb (c’est un exemple fictif qui n’a pas de lien direct avec le qcm mais qui permet de t’expliquer ce que j’ai écrit en gras)

je te mets des couleurs pour que tu puisses comprendre qu’est ce qui appartient au plasmide initial et qu’est ce qui appartient à l’insert 

 

Donc j’ai mon plasmide de départ avec des sites de restriction à :

- 250 pb (BamH1)

- 340 pb (Pst1) 

- 500 pb (HindIII)

- 1200 pb (Nco1)

 

Et j’ai un insert de 1200 pb avec un site Pst1 à 120 pb et un site Nco1 à 980 pb 

 

Donc je fais mon clonage avec Pst1 et Nco1 

Donc je coupe mon plasmide à 340 pb et à 1200 pb et j’ai donc un insert qui va faire : 1200 - 340 = 860 pb  (c’est la partie donc je vais me séparer)

Maintenant, je veux mettre mon insert (donc mon fragment d’ADNc d’intérêt) dans mon plasmide 

Je calcule la taille de mon insert : 980 - 120 = 860 pb 

 

Donc je remplace le fragment que j’avais initialement dans le plasmide par le fragment de l’insert 

Donc tu vois que finalement l’insert et le plasmide ont la même taille, donc si je digère mon plasmide initial par BamH1 ou mon plasmide recombinant par BamH1, je linéarise mon plasmide dans les deux cas mais j’obtiens une bande à 2,3 kpb 

Donc je ne peux pas savoir si j’ai le plasmide recombinant ou le plasmide initial 

 

Est-ce que c’est un peu plus clair pour toi ? 

[PetiteComète]

il y a une heure, Cassolnousmanque2 a dit :

Donc je ne peux pas savoir si j’ai le plasmide recombinant ou le plasmide initial

Est-ce que c’est un peu plus clair pour toi ? 

Oui c'est super, j'avais pas pensé au faite que l'on puisse avoir au finale le même nombre de pb pour les deux : merci pour toutes ces explications @Cassolnousmanque2

[Cassolnousmanque2]

Avec plaisir !!