Questions de perfectionnement ​😅​

[Wiwii]

Bonjour Alors en revoyant les cours d'analyses du vivant et après la colle d'aujourd'hui j'aurais des questions pour vraiment complémenter ma compréhension:

 

1- afin de construire un plasmide recombinant: est-ce qu'il est obligatoire d'emporter le promoteur? car je vois que des fois on l'emporte pas (si oui dans quels cas?) ainsi que l'OriC? étant donné qu'elle ne marche que chez les bactéries je me dis qu'il faut penser à prendre l'Ori que si on va cloner dans un autre plasmide ou bactérie ? C'est surtout ce point qui me chiffonne je ne sais pas vraiment quand faut il faire attention au promoteur et à l'Ori C 

 

2-Quand on intègre le fragment dans le sens inverse (dans le cas d'un clonage non orienté) est-ce qu'on inverse les flèches aussi et donc toute l'orientation de 1er plasmide ? 

 

3- dans la colle d'aujourd'hui le fait qu'il y ait un terminateur en 1er suffisait pour dire qu'on pouvait pas utiliser les enzyme pour obtenir le plasmide recombinant, donc est-ce que à chaque fois qu'un terminateur est en 1ère position c'est comme si il arrêtait la transcription donc ça ne marche pas ?

 

Merci énormément 

 

 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Wiwii, 

1) Tu emportes la partie qui t’intéresse donc parfois elle contient le promoteur et parfois non. Par contre, dans tous les cas, pour qu’un gène soit exprimé il faut nécessairement un promoteur. En absence de promoteur, la séquence du gène qui t’intéresse sera bien intégrée dans le plasmide recombinant mais le gène ne sera jamais exprimé (donc toutes tes manipulations pour en arriver à ce stade ne serviront à rien. En plus réaliser un clonage c’est passer beaucoup de temps pour peu de résultats concluants donc autant faire directement une expérience qui est susceptible de marcher !)

Pour la séquence ORI, il faut la préserver dans tous les cas. Même si tu exprimes tes gènes chez des organismes eucaryotes, on passe quasiment toujours pas une étape chez les procayotes donc il faut préserver cette partie là. Et puis d’ailleurs, même les organismes eucaryotes possèdent des cellules procaryotes qui vivent en symbiose donc dans tous les cas il faut garder cette séquence là sinon on perdra le plasmide 

 

2) Tu vas juste inverser le sens de ton insert. Toutes les autres séquences présentes sur le plasmide resteront dans le même sens

 

3) Oui voilà exactement. La transcription s’arrête et donc tout ce qui est en aval ne sera pas transcrit.

 

Bon courage ;) 

[Le_P'tit_Kiwi]

Coucouu!

Je tente une petite réponse qui pourra peut-être t'éclairer (je laisse mes collègues confirmer car ce chapitre n'est pas ma spécialité !)

 

1) En soit tu peux avoir les deux cas, le promoteur peut être emporté comme ne pas l'être. On fait comme on veut. La seule chose qui change c'est que si tu n'emportes pas le promoteur tu ne pourras pas exprimer le gène (logique, pour être exprimé il faut obligatoirement un promoteur).

OriC c'est l'origine de réplication des bactéries, c'est vraiment le truc à avoir à mon avis, car sans celui-ci tu ne peux faire aucune réplication. Je dirais qu'à partir du moment ou tu travailles avec des bactéries tu es obligé de garder cette séquence sinon tu pourras rien faire. Donc en soit si on raisonne comme ça, dans les exos en général faut toujours garder l'OriC. Je dis ça parce qu'en général dans les exos on teste si le plasmide a été intégré ou non, et pour vérifier ça il faut bien passer à un moment par la réplication de la bactérie. (ce n'est que mon avis je ne suis pas sûre de moi la dessus)

 

2) Euhhh alors là je veux pas te dire de bêtises... Je dirais que tu auras uniquement ton fragment inséré en sens inverse, mais que ça n'impactera pas ton premier plasmide .. mais je ne sais pas trop..

Puis j'ai envie de dire en soit en faisant cette expérience on s'en fiche un peu du premier plasmide après l'insertion...

 

3) Pour moi oui, dès qu'il y a un terminateur c'est finito pipo, donc peu importe tes enzymes la transcription ne se fera pas pour ce qui se trouve après le terminateur.

 

 

Bon couraaaage!  (et excuse moi mes réponses sont un peu bancales haha !)

[barbiedocteur]

Coucou je viens confirmer a réponse de @Le_P'tit_Kiwi! Je reviens juste sur les points 1 et 2 :

Pour le premier point je préciserai qu'en effet qu'en tu digère ton plasmide tu fais ce que tu veux : tu peux ajouter un promoteur devant une séquence / mettre une séquence à la suite d'un promoteur / ajouter un promoteur + une séquence dans un plasmide receveur... Le tout c'est de toujours avoir un promoteur et un terminateur pour que le gène puisse être transcrit et potentiellement s'exprimer. 

Quant à ORI tout plasmide doit le posséder, sinon on ne peut pas les utiliser (donc que ce soit pour les cellules eucaryotes ou procaryotes)

 

1 hour ago, Wiwii said:

2-Quand on intègre le fragment dans le sens inverse (dans le cas d'un clonage non orienté) est-ce qu'on inverse les flèches aussi et donc toute l'orientation de 1er plasmide ? 

 

non c'est seulement le fragment qu'on a coupé qui avant de s'intégrer au plasmide receveur, va se tourner dans un sens ou dans l'autre. Le plasmide donneur lui (donc le premier) fait sa vie de son côté sans etre impacté par le sens d'insertion de l'insert

 

[Wiwii]

Merci beaucoup à vous 3, vous m'avez clairement éclairée là !! 

 

Juste une dernière question: si j'emporte ma séquence du plasmide donneur sans le promoteur (par ex procaryote) => est-ce que dans le plasmide receveur le promoteur procaryote de ce plasmide peut marcher pour exprimer ce gène ? et idem si je prend ma séquence sans le promoteur eucaryote et que je la met devant un promoteur eucaryote dans le plasmide receveur => va t il être exprimer ?? 

 

En gros ma question : est-ce que le promoteur est spécifique de la séquence qui suit ? ou faut que je fasse juste attention a ce que ce soit avec procaryote ou eucaryote ? 

[emylyyy]

Ta séquence n'est pas spécifique d'un promoteur en particulier !

 

Ce qui compte c'est qu'on ait un promoteur avant peut importe si c'est le promoteur X ou Y; s'il change entre ton plasmide 1 et ton plasmide final, on a juste besoin d'un promoteur avant la séquence d'intérêt et c'est lui va dicter ou s'exprime notre séquence. 

 

Exemple : on à deux construction 

 

-----Promoteur procaryote---Sequence----Terminateur 

 

-------Promoteur eucaryote cancer spécifique-------Terminateur 

 

Dans le cas 1 notre séquence sera traduite que dans les procaryote mais si on met la meme séquence dans la construction 2 notre séquence sera traduite dans les tumeurs eucaryote. 

 

 

 

 

[Cassolnousmanque2]

Il y a 1 heure, emylyyy a dit :

Dans le cas 1 notre séquence sera traduite que dans les procaryote mais si on met la meme séquence dans la construction 2 notre séquence sera traduite dans les tumeurs eucaryote. 

 

Attention au passage eucaryote <-> procaryote puisque les séquences destinées aux eucaryotes doivent avoir un site de polyadénylation dans le vecteur de clonage 

[davidd]

il y a 6 minutes, Cassolnousmanque2 a dit :

Attention au passage eucaryote <-> procaryote puisque les séquences destinées aux eucaryotes doivent avoir un site de polyadénylation dans le vecteur de clonage 

hey @Cassolnousmanque2 !! cette notion me dis vraiment quelques choses et je sais que ça peut tomber en item de cours mais dans des exos ça ressembles a quoi ce qu'on doit verifier ? 

[Cassolnousmanque2]

@davidd, je cherche si je le vois dans les annales ou pas 

Update : https://tutoweb.org/PDFs/Librairie/Archive PACES/Maraîchers/Annales concours/2016-2017/S2 - Concours Maraîchers Mai 2017.pdf

énoncé commun aux qcm 1 à 4 de l'épreuve d'initiation à la recherche 

[davidd]

à l’instant, Cassolnousmanque2 a dit :

@davidd, je cherche si je le vois dans les annales ou pas 

MERCI BEAUCOUP !! 

Update : c'est quoi cette vitesse ?!?! ( je regarde dessuite )

[Cassolnousmanque2]

Update 2 : https://tutoweb.org/PDFs/Librairie/Archive PACES/Maraîchers/Annales concours/2010-2011/S2 - Concours Maraîchers Mai 2011.pdf

énoncé qcm 1 épreuve d'initiation à la recherche 

il y a 5 minutes, davidd a dit :

Update : c'est quoi cette vitesse ?!?! ( je regarde dessuite )

ahahaha ça s'appelle répondre de manière efficace ;) 

[davidd]

il y a 23 minutes, Cassolnousmanque2 a dit :

ahahaha ça s'appelle répondre de manière efficace ;) 

@Cassolnousmanque2 tu es un robot !!! merci infiniment 

 

je me permet de te poser une derniere question sur cette fameuse queue poly A en effet je me demande si la réciproque est vrai à savoir est ce que le fait d'avoir une poly a est bloquant pour le passage eucaryote vers procaryote

[Cassolnousmanque2]

Si tu as une protéine qui a besoin de sa queue polyA pour s’exprimer alors effectivement ça pose un soucis chez les procaryotes

@davidd 

[davidd]

Il y a 12 heures, Cassolnousmanque2 a dit :

ahahaha ça s'appelle répondre de manière efficace ;) 

@Cassolnousmanque2 merci beaucoup !!! comme d'habitude !! 

[Wiwii]

Vous êtes les meilleurs !!! merci :)