Chromatographie appliquée aux protéines

[Vous-ne-PASSerez-pas]

Coucou (je crois que je suis pas dans la bonne section, mea culpa), dans le cours sur les techniques d'études du vivant de Mme. Lajoie dit la chose suivante concernant le principe général de chromato : "la phase stationnaire sert à retenir les protéines d'après leurs caractéristiques physico-chimiques" et plus loin elle dit que celles qui nous intéressent sont celles qui se sont fixées puis qu'on a récupérées en éluant. Ma question est la suivante : est-ce que la phase stationnaire (sa composition) est faîte en fonction de la protéine d’intérêt (dans les diapos du dessus elle dit que c'est important de connaitre la prot qu'on veut pour trouver des astuces pour l'isoler). En gros est-ce que les phases utilisées sont spécifiques d'une prot donnée ou c'est un espèce d'entonnoir qui sépare le tout ? Genre si on sait que notre prot d’intérêt a une affinité pour une charge A, est-ce qu'on place cette charge A dans notre phase intentionnellement dans le but de l'attirer et la fixer? 

 

Je sais pas si c'est très clair, merci d'avance (j'ai conscience que je pousse un peu trop la compréhension pour une fois)

Edited January 17, 2023 by Vous-ne-PASSerez-pas

[Moustache]

Coucou @Vous-ne-PASSerez-pas

Pour répondre à ta question, c'est totalement ça!!! Par exemple pour une chromatographie échangeuse d'anions, tu vas avoir une phase stationnaire chargée positivement. T'as un mélange d'ions chargés positivement et négativement. Toi ce que tu veux, c'est récupérer les ions chargés négativement donc tu passes ce mélange dans la chromato et seuls les ions chargés négativement vont s'accrocher à la phase stationnaire chargée positivement. Donc oui la phase stationnaire dépend totalement de la protéine d'intérêt sinon tu ne pourras pas récupérer tes protéines d'intérêts. 

Je laisse un tuteur ou RM confirmer, on sait jamais 

[coquillette]

Coucou @Vous-ne-PASSerez-pas !

 

Ha @Moustache tu as été plus rapide que moi ! 

 

Oui c'est ça le principe ! Tu vas faire en sorte que ta phase stationnaire ait le petit truc qui retiennent ta protéine (assez souvent ce sont des charges). C'est bien la phase stationnaire qui doit s'adapter à ta protéine. C'est donc pour ça qu'il faut bien savoir à quel type de protéine on s'intéresse. 

 

Tu donnes toi même un très bon exemple : si ma protéine est attirée par A alors je mets A sur ma colonne. La protéine est retenue et je peux la récupérer par élution. 

 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Vous-ne-PASSerez-pas, 

Je suis d'accord avec les deux réponses précédentes, mais aussi parfois, quand tu ne sais pas quelles propriétés a ta protéine d'intérêt, tu fais des chromato et tu analyses ensuite tes deux échantillons : celui du volume mort (échantillon 1) et celui obtenu après élution (échantillon 2)

Par exemple tu peux tout à fait faire un WB a postériori pour voir si ta protéine d'intérêt est présente dans tel ou tel échantillon et en fonction tu en déduis ses propriétés 

 

Si je fais l'exemple concret : j'ai ma protéine C et je ne connais pas ses propriétés 

1) Je commence par vérifier que ma protéine C est présente dans mon échantillon initial (échantillon 0)

=> Elle est présente alors je passe à l'étape 2 

2) Je dépose mon échantillon 0 sur une colonne échangeuse de cations 

Je récupère le volume mort qui forme l'échantillon 1 et l'éluat qui forme l'échantillon 2 

3) Je fais un WB (Western Blot) avec des anticorps anti protéine C sur les échantillons 1 et 2 

Si ma protéine est dans l'échantillon 1 alors elle est négative 

Si ma protéine est dans l'échantillon 2 alors elle est positive 

 

Bon courage pour la suite

[Vous-ne-PASSerez-pas]

merci pour vos réponses 

[Cassolnousmanque2]

avec plaisir ;)