Techniques ADN

[Laulau13]

Bonjour j’ai une question concernant une annale. L’énoncé est le suivant : « Pour obtenir le vecteur pCOV-PRO, les plasmides pCOV et PPROM sont digérés par l’enzyme HindIII. Par la suite les fragments d’ADN correspondant au promoteur procaryote issu de pPROM et au vecteur sans le promoteur eucaryote issu de pCOV sont purifiés et mis en présence dans un tube contenant tous les éléments nécessaires a une ligation. Des bactéries sont ensuite transformées par le produit de ligation. Les chercheurs souhaitent obtenir un plasmide contenant le promoteur procaryote correctement orienté en amont de la séquence fondant COV2. » et l’item est le suivant « Quel que soit le sens d’insertion du promoteur dans le plasmide pCOV, il peut y avoir transcription de l’ADNc de COV2 » et il est faux… je ne comprend pas très bien pourquoi …

Merci d’avance 

 

[totov31]

Salut @Laulau13, soit je suis fou soit tu n'as pas réussi à mettre l'énoncé :)

[barbiedocteur]

Coucou @Laulau13

Déjà voici un petit schéma pour illustrer ce qu'on te dit dans l'énoncé :

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/03/660x.jpg

Ce qui est clef ici c'est qu'en l'utilisant 2 fois la même enzyme de restriction (HindIII), on aura un clonage non orienté. Le promoteur peut se mettre dans un sens ou dans l'autre, mais le soucis c'est qu'en s'orientant dans le sens opposé au gène qu'on cherche à transcrire (schéma en bas à droite), les polymérases ne pourront pas transcrire le gène, puisqu'il y a une limite au nombre de paires de bases qu'elles peuvent transcrire (en gros elles pourront pas faire tout le tour du plasmide jusqu'à arriver au gène d'intérêt parce que le chemin est trop long). Donc le gène ne sera pas forcément transcrit en fonction du sens dans lequel s'insère dans le plasmide!

Est-ce que c'est plus clair pour toi ?