Technique

[Evanninho]

Bonjour il y a qq notion que je n’ai pas compris et j’aimerai bien un peu d’aide svp :

 

1) dans l’item 19 et 20 on nous parle du séquençage et plus précisément des amorces je n’arrive pas à capté quel sens doivent avoir les amorces ( vous me dites si je me trompe : l’amorce qu’on choisit sur le plasmide = matrice donc ici l’amorce 1 et donc elle va être le complémentaire de notre séquence d’interrt . Sur le schéma du 19 dc est rpz la séquence d’intérêt et donc le complètementaiee de l’amorce 1 ? ) 

 

2) dans les protéines j’ai pas bien capté pk on avait des charges de l’échantillon et à quoi ça correspond dans les schémas de DO ? 
 

3) concernant les étiquettes j’ai pas très bien compris la slide 27 si qq peut m’expliquer en vif 

 

Voilà merci d’avance !! 

[totov31]

Salut @Evanninho !

Alors déjà pour la question 3 concernant les étiquettes, la slide 27 explique le fait que tu peux rajouter ce qu'on appelle des étiquettes à ta séquence d'intérêt pour faciliter le processus de purification des protéines.

Purifier une protéine = "Obtention de la protéine isolée dans sa conformation native (non dénaturée, avec un haut degré de pureté et un bon rendement".

Donc les étiquettes vont permettre d'isoler plus facilement la protéine et d'augmenter le degré de pureté ainsi que le rendement.

Par exemple, certaines étiquettes vont faciliter la purification par chromatographie, d'autres vont permettre à la protéine d'être sécrétée et donc d'être récupérée plus facilement...

[the_last_dandelion]

Il y a 3 heures, Evanninho a dit :

2) dans les protéines j’ai pas bien capté pk on avait des charges de l’échantillon et à quoi ça correspond dans les schémas de DO ? 

@Evanninho

Coucou à toi ! 

Pour répondre à ta deuxième interrogation, le "charge" noté sur le schéma du cours ne correspond pas à une charge (positive ou négative) des protéines, c'est littéralement la charge de ton échantillon : c'est-à-dire le moment où tu ajoutes toutes les protéines dans ton tube. Tu as donc une absorbance retranscrite dans le DO qui correspond à toutes ces nouvelles protéines :)

 

Alors, je t'avoue que j'ai un peu du mal à comprendre ta première question, donc n'hésite pas à me demander des précisions par la suite si je réponds à côté () : 

Les amorces qu'on utilise dans le séquençage (et qui vont être élongées avant d'être stoppées par des ddXTP) sont complémentaires au brin matrice, donc complémentaires à ta séquence d'intérêt.

Donc si dans l'item 19.C on te propose une séquence complémentaire au brin obtenu par séquençage, ça pourra correspond au brin codant pour la protéine BAW oui (sous réserve que ça soit la bonne amorce et tout, mais je ne me suis pas forcément penchée là-dessus j'avoue). 

 

Révélation

@AAAAHet @barbiedocteursi vous pouviez confirmer ça svp que je ne dise pas n'importe quoi .

et aussi @Cassolnousmanque2 avec tes grandes connaissances en génome .

 

Edited January 17, 2023 by the_last_dandelion

[barbiedocteur]

Coucou ! Merci pour la réponse @the_last_dandelionje viens juste pour compéter un peu la réponse de @totov31 sur les étiquettes !

L'étiquette en gros c'est un peut comme un AirTag (sponso Apple). Tu ajoute une séquence codant ton étiquette à la suite de l'ADNc codant ta protéine, et ça te permet d'obtenir une protéine avec une étiquette "collée". C'est utile pour savoir où se trouve la protéine par exemple (si on utilise des Ac spécifiques de l'étiquette fluorescents) - pour la purifier aussi (en connaissant les affinités particulières de l'étiquette avec un support, l'étiquette va être retenue et mal protéine avec). Et quand t'as plus besoin de ton étiquette tu peux l'éliminer par coupure enzymatique.

En fait l'étiquette c'est une séquence dont on connait plein de propriétés, et ça va être bien pratique pour étudier des protéines (Si tu veux repérer l'emplacement sub-cellulaire d'une protéine par fluorescence mais tu ne connais aucun Ac spécifique de la protéine, ben t'es coincé...)

Hésite pas à nous dire si c'est plus clair ou si tu veux qu'on te ré-explique certains points !

[Evanninho]

@the_last_dandelion @totov31Déjà merci à vous deux pour vos réponses elles sont bien cool bien carré ! Juste dc les points ou c’est encore floue pour moi : 

Il y a 1 heure, the_last_dandelion a dit :

charge de ton échantillon

Oui oui mais j’avais bien compris que ça correspondait à l’absorbance des prot mais ce que je ne comprend c’est pk on a un gros bloc gris comme ça devant les pics pour les prot que l’on appelle «charge de l’échantillon» 

 

Il y a 1 heure, the_last_dandelion a dit :

donc complémentaires à ta séquence d'intérêt.

D’accord donc sur le plasmide du 17 il faut choisir l’amorce 1 pour qu’elle soit le complémentaire de la séquence d’intérêt et donc ce qu’on retrouve sur le schéma avec les 4 colonnes correspond à la séquence d’intérêt c’est ça ou je me trompe ? 
 

 Et @barbiedocteur merci à toi aussi dc les étiquettes c’est ok mtn 

 

et juste un dernier point c’est important de bien différencier centrifugation extraction et isolation ? 

[the_last_dandelion]

Il y a 1 heure, Evanninho a dit :

un gros bloc gris comme ça devant les pics pour les prot que l’on appelle «charge de l’échantillon» 

@Evanninho

Là je t'avoue que je pars plutôt sur une supposition, mais je pense que comme tu rajoutes toutes les protéines d'un coup, toutes les absorbances apparaissent en bazar et tu as un gros "bloc" . Et ensuite, quand les protéines s'éluent une par une, tu as des jolis pics.

 

Il y a 1 heure, Evanninho a dit :

D’accord donc sur le plasmide du 17 il faut choisir l’amorce 1 pour qu’elle soit le complémentaire de la séquence d’intérêt et donc ce qu’on retrouve sur le schéma avec les 4 colonnes correspond à la séquence d’intérêt c’est ça ou je me trompe ?

Du coup après avoir eu la correction et lu en détail les énoncés des QCMs précédents je reviens sur ma réponse (oups ).

L'amorce 1 sera complémentaire à la séquence d'intérêt oui, et correspond à ce que tu retrouves sur l'électrophorèse : la séquence d'intérêt est le complémentaire de ce qui est séquencé sur ton schéma. 

 

Il y a 1 heure, Evanninho a dit :

c’est important de bien différencier centrifugation extraction et isolation ? 

Il faut pouvoir les nuancer dans l'idéal oui (après pas sûre que ce soit des sujets d'items...).  

Edited January 17, 2023 by the_last_dandelion

[Evanninho]

@the_last_dandelion dsl j’croyais l’avoir fait dc 17)AB 18)BDE 19)BCE 20)CDE si jamais c’est la colle de l’année dernière 

[the_last_dandelion]

il y a 25 minutes, Evanninho a dit :

dsl j’croyais l’avoir fait dc 17)AB 18)BDE 19)BCE 20)CDE si jamais c’est la colle de l’année dernière 

@Evanninho

Ok merci  ! Est-ce-que c'est bon pour toi sinon ? Ou est-ce qu'il te faut plus de précisions ? 

[Evanninho]

@the_last_dandelion ok ok mais comment savoir que le schéma avec les 4 colonnes c’est le gêne d’intérêt ou le brin de l’amorce ? 

[the_last_dandelion]

il y a 1 minute, Evanninho a dit :

ok ok mais comment savoir que le schéma avec les 4 colonnes c’est le gêne d’intérêt ou le brin de l’amorce ? 

@Evanninho

Quand tu séquences avec la technique de Sanger, le brin séquencé sera toujours le brin complémentaire à la matrice (synthétisé à partir de l'amorce). Donc sur ton électrophorèse, tu liras toujours le brin complémentaire, et tu devras en déduire le brin matrice = le gêne d'intérêt ! 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Evanninho, alors je viens à peine de lire le sujet

Déjà première chose, par pitié on arrête le amorce = matrice

Petit rappel : 

Amorce = oligonucléotides (ARN ou ADN) qu'on va mettre dans le milieu, qui sont complémentaires à la séquence à amplifier et qui vont permettre de synthétiser le brin complémentaire et permettent l'action des ADN polymérases qui, je le rappelle, ne peuvent pas commencer une synthèse sans amorce 

Matrice = brin complémentaire à partir duquel on va synthétiser le brin d'intérêt 

Du coup si on fait une phrase avec les deux mots ça donne : Une amorce peut permettre l'action des ADN polymérases qui synthétiseront le brin complémentaire à partir de la matrice

 

Pour la question 1 : en l'occurence, puisque le promoteur va vers la gauche sur le schéma et que l'amorce 1 va vers la droite sur le schéma alors : 

l'amorce correspond à la séquence complémentaire de l'ARNm qui sera potentiellement transcrit

 

Et après je confirme tout ce qui a été dit plus haut !! 

 

[Evanninho]

@the_last_dandelion @Cassolnousmanque2 

il y a 27 minutes, Cassolnousmanque2 a dit :

par pitié on arrête le amorce = matrice

Oui oui je sais bien tu me l’avais pas mal répéter au s1 mais enfaite j’ai compris mon erreur sayer donc là pour de bon si je résume :

-on part du plasmide on prend l’amorce 1 qui a pour matrice le brin qu’on cherche à séquencer ensuite donc on prend l’amorce 1 on synthétise et on obtient le brin complètementaire du brin qu’on cherche à séquencer

-electrophorese ou on met le brin complètementaire = amorce 1 et donc on à séquencer notre amorce 1 en 5’ —> 3’ en partant du bas vers le haut du schéma à 4 colonne et on peut en déduire le complémentaire = à notre fameuse séquence rechercher

j’suis bon cette fois avec le sequencage ou j’inverse encore des étapes ? 

[Cassolnousmanque2]

il y a 2 minutes, Evanninho a dit :

Oui oui je sais bien tu me l’avais pas mal répéter au s1

t'inquiète pas je le redirai encore s'il faut

Et si j'ai bien suivi ton explication je crois qu'on est bon !