plasmides

[ryad213]

Bonsoir j'ai du mal avec la resolution des qcms types sur les plasmides avec l'intégration de notre séquence d'interêt,quelles enzymes de restriction choisir et surtout pour déterminer la taille des fragments. 

 

Si quelqu'un pourrait m'expliquer, ça m'aiderai à tout clarifier.

 

Merci d'avance!

[AAAAH]

Coucou !

 

Explication et description des éléments présents sur le schéma général d'un plasmide : https://forum.tutoweb.org/topic/86396-vecteur-plasmide/#comment-460626

Méthodologie QCMs avec plasmides : https://forum.tutoweb.org/topic/78945-à-laide-techniques-du-vivant-je-suis-paumée/?do=findComment&comment=425221

Trouver la taille des fragments dans un plasmide : https://forum.tutoweb.org/topic/75599-annales-maraîchers-2018-qcm-2/?do=findComment&comment=407595

Différents types de promoteurs : https://forum.tutoweb.org/topic/59611-différents-types-de-promoteurs/?do=findComment&comment=318094

 

Voilà quelques sujets qui pourraient t'aider pour commencer, sinon si un tuteur passe par là et se sent de détailler le processus ce serait super 

[barbiedocteur]

14 minutes ago, AAAAH said:

si un tuteur passe par là et se sent de détailler le processus ce serait super

moi je suis chaud bouillant j'attends que ça depuis le début de la journée

si @Ryad_213t'as un QCM précis que tu voudrai qu'on regarde ensemble hésite pas !!

[Cassolnousmanque2]

Pareil, si besoin je peux t'aider ;) 

[AAAAH]

Quelle motivation c'est beau 

Merci beaucoup @barbiedocteur et @Cassolnousmanque2 !

[ryad213]

@barbiedocteur @Cassolnousmanque2 @AAAAH Merci pour votre dévouement c’est gentil

J’ai justement un QCM qui me posait problème je vous le met juste ici : 

 

https://ibb.co/K26Mqv6

[Cassolnousmanque2]

Je regarde ça de suite !

Alors déjà il faut que tu essayes de comprendre quel vecteur parmi les deux est le vecteur donneur et lequel est le vecteur receveur qui deviendra ensuite vecteur recombinant 

Dans l'énoncé on te dit qu'on va introduire le promoteur tissu spécifique eucaryote de pPROM dans le vecteur plasminine 

=> pPROM est le vecteur donneur et plasminine le vecteur receveur 

 

A. On te dit ensuite qu'on va utiliser deux enzymes de restriction différentes : BamH1 et Pst1 pour digérer les deux plasmides 

A priori, puisqu'on ne te dit pas que ces deux enzymes sont complémentaires, alors elles ne sont pas complémentaires (tu pars toujours de ce principe là quand tu as deux enzymes de restriction différentes. Et pour le coup, comme je connais les séquences (tu n'as pas à les apprendre), je te confirme qu'elles ne sont pas complémentaires !)

=> On a donc un clonage ORIENTE : c'est à dire que l'insert ne peut se mettre que dans UN SEUL sens (je te fais le schéma ; le voici : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/02/bhft.jpeg (en noir le plasmide plaminine de départ, en orange l’insert, en violet les nouvelles positions des différents sites de restriction) )

 

-> donc l'item A est faux 

 

B. Tu vois que le promoteur tissu spécifique eucaryote dans le plasmide pPROM est encadré par 2 séquences BamH1. Par conséquent, si on avait utilisé BamH1, l'insert aurait une taille plus grande mais il aurait quand même pu être intégré dans le plasmide plasminine (je te fais le schéma ; le voici : https://zupimages.net/viewer.php?id=23/02/g5s0.jpeg (en noir le plasmide plaminine original, en orange l'insert)). Le plasmide recombinant aurait donc eu une taille beaucoup plus grande puisque déjà l'insert a une taille plus grande et qu'en plus on ne perdrait pas de séquence du vecteur plasminine initial contrairement au clonage avec BamH1 et Pst1

 

-> donc l'item B est vrai 

 

C. Puisque tu as un seul site BamH1 sur le plasmide recombinant (celui obtenu avec BamH1 et Pst1 = celui que je t'ai mis dans l'item A), alors tu vas effectivement linéariser ton plasmide 

Maintenant il te reste à calculer la taille de ton plasmide recombinant. Pour cela tu dois calculer la taille de différentes parties : 

Taille insert = séquence entre BamH1 et Pst1 de pPROM = 1500 - 800 = 700 pb 

Taille du fragment à enlever dans le vecteur plasminine = séquence entre BamH1 et Pst1 de plasminine = 1350 - 1300 = 50 pb 

Taille vecteur recombinant = 5200 - 50 + 700 = 5850 pb 

 

-> donc l'item C est vrai 

 

D. Il faut que tu regardes combien de sites HindIII sont présents dans ton plasmide recombinant (toujours celui obtenu par digestion et clonage avec BamH1 et Pst1, donc l'image du A.). Tu remarques qu'il y a 4 sites. 

Tu dois donc calculer la nouvelle position de ces sites dans ton plasmide recombinant 

Le premier reste à 1200 pb 

Le deuxième va changer de position 

Sur pPROM il est situé à 810 pb : 810 - 800 = 10 pb => entre BamH1 et HindIII il y a 10 pb 

Donc sa nouvelle position sera à +10 pb de celle de BamH1 

Celle de BamH1 ne va pas bouger donc la nouvelle position du deuxième HindIII = 1300 + 10 = 1310 pb 

Le troisième va aussi changer de position 

Sur pPROM il est situé à 1120 pb : 1120 - 800 = 320 pb => entre BamH1 et HindIII il y a 320 pb 

Donc sa nouvelle position sera à +320 pb de celle de BamH1

Celle de BamH1 est à 1300 pb : 1300 + 320 = 1620 pb

Le quatrième va aussi changer de position 

Sur plaminine il est situé à 2600 pb : 2600 - 1350 = 1250 pb => entre Pst1 et HindIII il y a 1250 pb 

Donc sa nouvelle position sera à +1250 pb de celle de Pst1

Celle de Pst1 est à 2000 pb : 2000 + 1250 = 3250 pb 

 

(Pour calculer la nouvelle position de Pst1 j'ai fait le même type de calcul : l'insert fait 700 pb donc le site pour pst1 sur le plasmide recombinant sera à +700 pb de celui de BamH1 : 1300 + 700 = 2000 pb)

 

Maintenant tu calcules les différentes tailles des fragments que tu obtiens en digérant le plasmide recombinant par HindIII : 

Entre le premier et le deuxième HindIII = 1310 - 1200 = 110 pb 

Entre le deuxième et le troisième HindIII = 1620 - 1310 = 310 pb 

Entre le troisième et le quatrième Hind III : 3250 - 1620 = 1630 pb 

Entre le quatrième et le premier Hind III : 5850 - 3250 + 1200 = 3800 pb 

 

Si on refait le compte on a : 110 + 310 + 1630 + 3800 = 5850 pb, ce qui correspond bien à la taille du vecteur recombinant qu'on avait calculée dans l'item C. Refaire le calcul te permet de vérifier que tu ne t'es pas trompé 

Pour résoudre cet item, il suffisait juste de voir qu'on obtenait 4 fragments et pas 3, ce qui rendait immédiatement l'item faux et t'exemptait de faire tous ces calculs (j'ai quand même développé pour te montrer la méthode à suivre parce que si l'item avait été vrai, tu aurais dû faire tous ces calculs là pour le vérifier)

 

-> donc l'item D est faux 

 

E. Le fragment de résistance à l'ampicilline est présent dans le vecteur pPROM mais il est absent du vecteur plaminine recombinant. Par conséquent les bactéries seront sensibles à cet antibiotiques. Par contre elles seront résistantes à la kanamycine

 

-> donc l'item E est faux 

 

Un bon entraînement pour voir si tu as compris serait de déterminer la position des enzymes de restriction dans le plasmide de l'item B. Si tu veux, je te dirai si c'est correct ou pas. Je ne les ai volontairement pas calculées pour te laisser faire même si dans le qcm ça n'était pas demandé

 

Voilà voilà, j'espère avoir pu t'aider. Si tu as d'autres questions ou que tu veux que je reprenne quelques points n'hésite pas 

Bon courage pour la colle de demain

 

[Midwiflower]

Salut @Cassolnousmanque2  je me suis incrustée et j’ai calculé les positions des enzymes de restrictions dans le plasmide de la B. Est ce que tu pourrait me dire le résultat pour corriger s’il te plaît ?

Edited January 15, 2023 by newPASS_31

[Cassolnousmanque2]

Coucou @newPASS_31, 

Bien sûr, voilà la correction : 

 

Premier Hind III : 1200 pb 

Premier BamH1 : 1300 pb 

Deuxième Hind III : 1310 pb 

EcoR1 : 1320 pb 

Xho1 : 1330 pb 

Troisième Hind III : 1620 pb 

Premier Pst1 : 2000 pb 

Deuxième BamH1 : 1600 - 800 = 800 => 1300 + 800 = 2100 pb 

Deuxième Pst1 : 1350 - 1300 = 50 => 2100 + 50 = 2150

Quatrième Hind III : 2600 - 1350 = 1250 => 2150 + 1250 = 3400 pb 

 

Donc si on refait le calcul des fragments qu'on obtiendrait théoriquement par digestion avec Hind III : 

Entre le premier et le deuxième Hind III : 1310 - 1200 = 110 pb 

Entre le deuxième et le troisième Hind III : 1620 - 1310 = 310 pb 

Entre le troisième et le quatrième Hind III : 3400 - 1620 = 1780 pb 

Entre le quatrième et le premier Hind III : 6000 - 3400 + 1200 = 3800 pb 

 

On refait le calcul de la taille totale du plasmide pour vérifier : 110 + 310 + 1780 + 3800 = 6000 pb 

Voilà ! Tu as trouvé pareil ? 

[Midwiflower]

Presque, je n'ai pas marqué le deuxième PST1, d’ailleurs il sort d’où

[Cassolnousmanque2]

@newPASS_31T'en as un qui est présent sur l'insert (en orange sur le schéma) et l'autre qui est déjà présent sur le plasmide original (donc en noir)