Étude du vivant

[Evanninho]

Bonjour j’ai qq question sur le cours de bettina ou j’ai pas très bien compris et j’aurais besoin d’aide svp :

 

1) je me trompe toujours de sens dans le séquencage donc j’ai marqué comme je le pensais sur le diapo dites moi si c’est le bon sens svp 

 

2) si la mère est transgénique (transgenese additive) alors tous ces enfants le seront aussi ? 
 

3) pk dans le séquencage on fait bcp de petit fragments ? J’crois j’ai pas compris le fond dû séquencage car j’arrive pas à comprendre pk les fragments qui sont coupés aléatoirement donneront les bonnes séquences et pas des choses aléatoires justement (si m’a question n’est pas clair dites le moi je reformule)

 

c’est tout pour moi et merci d’avance à la grande personne qui m’expliquera ces petits points que je n’arrive pas à comprendre 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Evanninho, 

Alors concernant tes différentes questions : 

1) Oui, on lit de bas en haut donc ton orientation me semble correcte 

2) J'aurais dit que non, cf la diapo 68 du cours du Pr Couderc, 

3) En gros le séquençage selon Sanger ça consiste à mettre dans un milieu tous les composants nécessaires pour le séquençage (amorce, dNTP, sels, eau...) et en plus on ajoute des ddNTP

Les ddNTP n'ont pas de OH en 3' donc ils ne peuvent pas établir de liaisons phsophodiester (oui je sais ça demande de se rappeler du génome du S1 ), donc la polymérisation va s'arrêter 

Si dans un tube je mets : dATP, dGTP, ddCTP (en concentration ++), dTTP, dCTP (en concentration +) et 1000 copies de ma séquence d'ADN 

Admettons que j'ai la séquence suivante : 

5' AGGTCGATCCAGTAGTCAG 3'

On aura les fragments suivants : 

5' AGGTC 3' 

5' AGGTCGATC 3' 

5' AGGTCGATCC 3' 

5' AGGTCGATCCAGTAGTC 3' ... 

 

Statistiquement, pour chaque C il y aura des dCTP qui seront intégrés, donc la polymérisation continuera, mais aussi des ddCTP qui arrêteront la polymérisation 

On pourra donc savoir quels nucléotides auront été incorporés grâce à une analyse UV ensuite, je sais pas si ça répond à ta question, mais du coup on aura plein de petits fragments de tailles différentes à cause des ddNTP !

 

Bon courage pour la suite

[Evanninho]

@Cassolnousmanque2 merci pour ta réponse ! Juste il y a qq truc que j’ai pas entièrement compris

 

2)il y a un moyen qu’on le vérifie ?  parce que la transgenese normalement ça transmet à tout l’organisme et c’est héréditaire donc ça devrait le transmettre ? et dans le diapo 68 ils n’ont pas tous le trait rose car il ne l’expriment pas tous mais ils peuvent tous l’avoir non ?

 

3)non non oui j’avais bien compris comment avoir des fragments je vais essayer de reformuler pour reprendre la base déjà si j’ai bien compris :on a des milliers de fragments et en fonction de leur taille ils vont migrer loin ou pas en fonction de leur migration chaque lettre de ddxtp marqué va avoir une position et donc en lisant l’electrophorese on a notre séquence en fonction de ces positions , seulement pour déterminer la taille des fragments et donc leur position c’est basé sur le hasard donc comment savoir que ma séquence au lieu d’être AGCA qui code pour une prot en particulier ça ne soit en réalité TGCA et donc qui ne code pas pour cette prot 

(c’est plus clair ma question ou tu vois tjs pas?)

[Cassolnousmanque2]

il y a 47 minutes, Evanninho a dit :

parce que la transgenese normalement ça transmet à tout l’organisme et c’est héréditaire donc ça devrait le transmettre ? et dans le diapo 68 ils n’ont pas tous le trait rose car il ne l’expriment pas tous mais ils peuvent tous l’avoir non ?

Oui mais comme tu l'as dit il n'est pas forcément exprimé, tout dépend du type de promoteur (procaryote/eucaryote, inductive/repressible/constitutif....) 

il y a 48 minutes, Evanninho a dit :

c’est basé sur le hasard donc comment savoir que ma séquence au lieu d’être AGCA qui code pour une prot en particulier ça ne soit en réalité TGCA et donc qui ne code pas pour cette prot 

Alors je t'explique par un exemple 

On prend 4 tubes : 

Tube 1 : dATP, dGTP, dTTP, dCTP, ddATP + séquence

Tube 2 : dATP, dGTP, dTTP, dCTP, ddGTP + séquence

Tube 3 : dATP, dGTP, dTTP, dCTP, ddTTP + séquence

Tube 4 : dATP, dGTP, dTTP, dCTP, ddCTP + séquence

 

On a la séquence d'ADN suivante : 5' AGTCGGATCGAT 3' 

On regarde ce que le séquençage donne dans les 4 tubes : 

Tube 1 : A ou AGTCGGA statistiquement 

Tube 2 : AG ou AGTCG statistiquement 

Tube 3 : AGT ou AGTCGGAT statistiquement 

Tube 4 : AGTC ou AGTCGGATC statistiquement 

 

Après pareil, ça continue comme je t'ai expliqué dans les 4 tubes

Ensuite tu fais migrer tous ces fragments là et en fonction de la taille tu as le profil de migration, tu peux lire de bas en haut et voilà 

Maintenant, la technique des 4 tubes est assez ancienne, aujourd'hui on utilise des techniques qui permettent de mélanger dans le même tube dATP, ddATP, dGTP, ddGTP, dCTP, ddCTP, dTTP et ddTTP 

Du coup résultat tu sais très précisément l'enchaînement de nucléotides, c'est pas de la déduction due au hasard

C'est plus clair ?