AMORCE PLASMIDE

[Selm]

Bonjour,

Alors je n'arrive pas a comprendre comment savoir quelle amorce est la bonne pour un plasmide sachant que l'ont a juste le schémas du plasmide et une le dépôt des différente amorce sur une électrophorèse 

Quelqu'un pourrait m'aider svpp mercii bcpp!!!!!

[AAAAH]

Coucou !

J'ai du mal à comprendre ta question, tu pourrais joindre une image de l'énoncé stp ? 

 

Tu peux utiliser ZupImages puis copier le "lien direct" dans un message sur le forum pour ajouter une photo.

 

Merci beaucoup !

[Selm]

Ohh superr mercii je galérer a envoyer des photo https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/oadv.png

voici le liens et en dessous il y a des questions que madame couderc a poser sur sont diapo et je ne comprend pas du tout mais vraiment pas Mercii

@AAAAH

[Cassolnousmanque2]

Coucou @Selm,

Alors pour reprendre point par point les questions du Pr Couderc : 

 

"Expliquez brièvement le principe de la technique de séquençage de l'ADN selon Sanger." 

Pour comprendre ce mécanisme là, il faut que tu aies bien compris comment fonctionne la réplication. Le but du séquençage et de déterminer la séquence de nucléotides présente dans ton fragment d'ADN. Pour cela, tu vas utiliser tous les composants nécessaires à la réplication (amorce, ADN matrice, ADN polymérase, sels, eau, nucléotides) et en plus des dNTP, tu vas utiliser des ddNTP. 

Les ddNTP ce sont des didésoxyribonucléotides. A la différence des désoxyribonucléotides (dNTP) qui n'ont pas de OH en 2' mais qui ont un OH en 3' pour réaliser les liaisons phosphodiester de 3' en 5', les ddNTP n'ont pas de OH en 2' ni en 3'. Par conséquent ils ne pourront pas former de liaisons phosphodiester, ce qui stoppera la polymérisation de l'ADN. Comme on aura préalablement étiqueté les différents ddNTP avec des colorants différents, alors cela nous permettra de savoir quel nucléotide a été incorporé, et donc de déterminer la séquence nucléotidique de l'ADN pendant sa réplication grâce à une exposition UV par exemple. Tu pourras ainsi lire la séquence d'ADN de bas en haut sur le gel d'électrophorèse !

(je t'invite à regarder les diapos 33 à 41 qui reprennent cette technique là un peu plus en détails) 

 

"Lire la séquence obtenue et l'orienter"

Du coup en lisant de bas en haut ça donne : 5' AGGCTTTTCAGGCCAGTGCCGGGACCTTTTTTACAGCCGTCAA 3' (normalement si je me suis pas plantée quelque part )

 

Pour les amorces, le brin hachuré c'est celui du haut ou celui du bas ? je n'arrive pas bien à voir sur la photo)

 

[Selm]

C'est  ceuli du haut et mercii je vais tout lire !

 

 

[Cassolnousmanque2]

Alors pour répliquer le brin du haut, il faut que tu utilises les amorces 3 et 1 

et l'autoradiographie correspond au brin A normalement ! (qui est complémentaire du brin B)

 

Bon courage

[Selm]

Okkk super pour connaitre les amorce ducoup vu que j'ai maintenant la séquence de nucléotides je n'ai qu'a faire comme au S1 pour trouver les amorces c'est bien sa ? ou pas du tt

[Cassolnousmanque2]

Alors oui, mais dans les questions de cette diapo on ne te demande pas de le faire 

[AshGrey]

1 hour ago, Cassolnousmanque2 said:

 l'autoradiographie correspond au brin A normalement ! (qui est complémentaire du brin B)

 

Hey, je tape l'incruste mais je voulais savoir pourquoi la réponse à cette question est le brin A et non le brin B. Car en utilisant l'amorce 3, on n'est pas censé synthétiser le brin B ?

[Cassolnousmanque2]

Hello @AshGrey, 

Effectivement l'amorce 3 va synthétiser le brin complémentaire au brin B, c'est-à-dire le brin A mais l'amorce 1 va synthétiser le brin complémentaire au brin A, c'est à dire le brin B 

La partie qu'on observe c'est le complémentaire de la séquence hachurée, donc le brin A (en tous cas je me souviens que c'est ce que le Pr Couderc avait dit il y a 2 ans..., après pour être honnête avec toi, il manque des infos à mon sens dans l'énoncé)

[AshGrey]

Désolé mais j'ai un peu du mal à visualiser donc comment on sait que la lecture de l'autoradiographie correspond au brin A ? c'est du à l'orientation de la lecture ? et aussi comment on sait que c'est le complémentaire de la séquence qu'on observe ?

[Lulu_le_Fou]

Il y a 8 heures, AshGrey a dit :

Désolé mais j'ai un peu du mal à visualiser donc comment on sait que la lecture de l'autoradiographie correspond au brin A ? c'est du à l'orientation de la lecture ? et aussi comment on sait que c'est le complémentaire de la séquence qu'on observe ?

Je me permet mais enfaite sur ton schéma tu vois que ton amorce 3 est en face du brin B, pour ça suffit d'avoir de bon yeux 

Ensuite, enfaite le truc c'est que quand tu élonge l'ADN, tu le fait par rapport au brin d'en face, or ici c'est le brin B puisque amorce 3 en face de B,

DONC tu vas obtenir le complémentaire du brin B à dernières nouvelles.

OR, il se trouve que le complémentaire du brin B créépar ton amorce et tes enzymes et tout n'est autre que l'autre brin qui est le A, puisque le A est aussi complémentaire du B. 

A = brin complémentaire synthétisé par l'amorce 3, enzymes...

oui c'est du à l'orientation de ton amorce et comment on sait que c'est le complémentaire, eh bien c'est une des règles fondamentale en génétique

Je sais pas comment être plus claire, bon courage et n'hésite pas parce que en recherche t'a officiellement 2 RMS mais officieusement 3 

Révélation

@Cassolnousmanque2 

 

Edited January 5, 2023 by Lulu_le_fou

[Cassolnousmanque2]

il y a 3 minutes, Lulu_le_fou a dit :

Je sais pas comment être plus claire, bon courage et n'hésite pas parce que en recherche t'a officiellement 2 RMS mais officieusement 3 

  Masquer le contenu

@Cassolnousmanque2  

 

Révélation

C'est gentil, en vrai je veux pas me faire taper dessus, je les laisse gérer (ils vont super bien s'en sortir je suis sure), je fais juste mon travail de tutrice haha (après ça n'empêche pas que je continuerai de vous expliquer ce que vous comprenez pas à la BU comme au S1, d'ailleurs si y en a d'autres qui veulent venir c'est avec plaisir )

 

[AshGrey]

Bon décidément, il faut que j'aille changer mes yeux parce que je n'avais tout simplement pas compris le schéma. Merci d'avoir précisé que c'était en face du brin B parce que je pensais que c'était sur le brin B.  Merci à vous deux @Lulu_le_fou et @Cassolnousmanque2 d'avoir pris le temps de m'expliquer un truc aussi simple.

[Selm]

@Cassolnousmanque2 mais je n'arrive pas a comprendre comment on peut trouver que c'est l'amorce 3 et 1 si on utilise pas ce qu'on a fait au S1 (dsll je galere)

[Lulu_le_Fou]

il y a une heure, Selm a dit :

@Cassolnousmanque2 mais je n'arrive pas a comprendre comment on peut trouver que c'est l'amorce 3 et 1 si on utilise pas ce qu'on a fait au S1 (dsll je galere)

L'amorce 3 est la seul dans le bon sens pour séquencer la partie hachurée et elle est bien orientée 5' 3', et oui ce qu'on a fait eu S1 n'est pas la pour faire jolie, il faut s'en servir ! 

[barbiedocteur]

Salut @Selm !! Pour trouver les amorces en effet c'est comme au S1, donc tkt pas ça devrai vite te revenir ;)

 

Ici la séquence d'intérêt est celle qui est hachurée donc on commence par regarder les 2 amorces les plus proches d'elle : les amorces 3 et 4. Pour savoir quelle amorce choisir on prend celle qui est orientée de 5' vers 3' (donc la 3). En effet le séquençage par la polymérase se fait de 5' vers 3' donc si on choisit l'amorce 4, en faisant le séquençage de 5' vers 3'on ne va pas transcrire le gène d'intérêt !! (je te laisse regarder l'image si ça peut t'aider). 

 

Et de la meme manière, pour choisir la seconde amorce, entre la 1 et la 2 on va choisir celle qui lorsqu'on va faire le séquençage permettra de transcrire le gène d'intérêt, donc celle orientée de 5' vers 3', soit la 1.

 

 

oulala les beaux pixels

En gros t'as bien besoin de te souvenir de ce que tu as appris au S1 sur la transcription ! Hésite pas si ça reste pas clair :)

[khaled]

13 hours ago, Cassolnousmanque2 said:

Alors pour répliquer le brin du haut, il faut que tu utilises les amorces 3 et 1 

et l'autoradiographie correspond au brin A normalement ! (qui est complémentaire du brin B)

 

Bon courage

salut, j'avais une question

qu'est ce qui nous empêche d'utiliser les amorces 2 et 4 ?

[Cassolnousmanque2]

Coucou @khaled, le fait que la technique soit limitée à 300 pb et que ton plasmide soit beaucoup plus grand 

[khaled]

6 minutes ago, Cassolnousmanque2 said:

Coucou @khaled, le fait que la technique soit limitée à 300 pb et que ton plasmide soit beaucoup plus grand 

dsl j'ai toujours pas compris, si on utilise 2 et 4 et qu'on utilise pas 1 et 3 c'est possible? ou alors je dis des betises

Edited January 5, 2023 by khaled

[Cassolnousmanque2]

@khaledDans ce cas, tu vas séquencer la partie de gauche de ton plasmide (selon ce schéma) : regarde le sens des flèches 

 

Or dans l'énoncé on te dit que le fragment d'ADN cloné entre EcoR1 et HindIII fait 1,5 kb = 1500 pb donc tu vois bien que ton plasmide est beaucoup plus grand que 1500 pb ce qui est déjà largement supérieur à 300 pb 

 

Donc autant prendre directement les amorces 1 et 3 et séquencer la partie qui t'intéresse ;)

[barbiedocteur]

1 minute ago, khaled said:

dsl j'ai toujours pas compris, si on utilise 2 et 4 et qu'on utilise pas 1 et 3 c'est possible?

Théoriquement oui, parce que en soit le plasmide étant circulaire ta petite polymérise ferai tout le tour et finirait bien par séquencer ce qu'on veut, mais comme l'a bien dit Cassolnousmanque2 la technique Sanger a ses limites et donc ça marcherai pas avec ce plasmide ;)

Mais dans les QCMs on ne te piègera pas la-dessus, il faudra toujours considérer que tu essaie de faire "au plus court", avec les amorces 1 et 3 donc

[khaled]

5 minutes ago, Cassolnousmanque2 said:

@khaledDans ce cas, tu vas séquencer la partie de gauche de ton plasmide (selon ce schéma) : regarde le sens des flèches 

 

Or dans l'énoncé on te dit que le fragment d'ADN cloné entre EcoR1 et HindIII fait 1,5 kb = 1500 pb donc tu vois bien que ton plasmide est beaucoup plus grand que 1500 pb ce qui est déjà largement supérieur à 300 pb 

 

Donc autant prendre directement les amorces 1 et 3 et séquencer la partie qui t'intéresse ;)

wow merci beaucoup j'ai compris c'est donc juste une histoire du nombre de pb

 

4 minutes ago, barbiedocteur said:

Théoriquement oui, parce que en soit le plasmide étant circulaire ta petite polymérise ferai tout le tour et finirait bien par séquencer ce qu'on veut, mais comme l'a bien dit Cassolnousmanque2 la technique Sanger a ses limites et donc ça marcherai pas avec ce plasmide ;)

Mais dans les QCMs on ne te piègera pas la-dessus, il faudra toujours considérer que tu essaie de faire "au plus court", avec les amorces 1 et 3 donc

Merci beaucoup j'ai capté!

[Cassolnousmanque2]

à l’instant, khaled a dit :

wow merci beaucoup j'ai compris c'est donc juste une histoire du nombre de pb

yes exact ! Bon courage warrior

[Selm]

Wahouuuuu toutes vos expliquation sont incroyable merciii bcppp j'ai tout compris !!!!