Technique recherche

[PEPETTE]

Salut les tuteurs, pourriez vous m'aider pour ce QCM je ne comprends pas comment faire...

 

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/wwun.png

 

Et aussi dans ce type de QCM ils demandent souvent de trouver la taille, auriez vous une astuce ? 

 

Merciii

[cellulesouches]

@AAAAH 

[PEPETTE]

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/sze1.png

 

Je vous mets plutôt cet exemple (qui vient du poly) pour la taille la D est juste et je n'arrive pas à comprendre d'où sort 1300; 630 et 670

[davidd]

C'est toujours la meme chose check ça tu comprendras peut etre mieux je pense 

[Cassolnousmanque2]

Coucou @PEPETTE(je continue d'ecrire mais déjà tu as le début de la réponse)

Alors déjà ce type de qcm est très classique et revient très souvent (tu peux être quasiment sûre qu'il y en aura un similaire à l'examen)

 

A) Pour savoir si tu peux utiliser les enzymes de restriction qu'on te propose, tu regardes dans un premier temps si elles sont présentes sur l'insert (ici présent dans le vecteur pCK-CXCL1) et tu regardes aussi si elles sont présentes dans le vecteur que tu vas utiliser pour la transfection (puisqu'on est chez les eucaryotes ici)

1) Si les enzymes de restriction sont présentes dans les deux cas -> on passe à l'étape suivante 

Sinon -> tu regardes si les enzymes disponibles ne seraient pas complémentaires de celles qu'on te propose, ce qui permettrait une bonne intégration (cas rare qu'ils ne vous mettront pas je pense) ou alors si elles ne sont pas complémentaires alors tu en déduis qu'on ne peut pas les utiliser 

2) Tu regardes si les enzymes de restriction ne vont pas couper en plein milieu de la séquence d'intérêt dans l'exercice (ici CXCL1), ce qui empêcherait d'obtenir à la fin le produit voulu 

Tu regardes aussi que les codons d'initiation et stop de la traduction soient bien compris entre tes deux enzymes de restriction 

 

Concrètement ici dans l'item : 

BamH1 et Pst1 sont de part et d'autre de la séquence CXCL1 de pCK-CXCL1 qu'on veut mettre ensuite dans pPACES mais aussi on a un Pst1 en plein milieu de la séquence de CXCL1

BamH1 et Pst1 sont présentes dans le site multiple de clonage avec en amont un promoteur eucaryote constitutif (= il est exprimé en continu)

 

Pour rappel, le clonage orienté fait intervenir 2 enzymes de restriction différentes et non complémentaires, ce qui est le cas ici MAIS comme tu as Pst1 en plein milieu de la séquence d'intérêt, alors tu ne peux pas l'utiliser 

Les bonnes enzymes de restriction à utiliser ici sont BamH1 2 fois => tu as donc un clonage NON orienté 

Item A faux  

 

B) Pour savoir si tu es en présence de vecteurs recombinants ou pas, tu dois regarder si les vecteurs possèdent des séquences de résistance à des antibiotiques 

Ici tu vois que pCK-CXCL1 possède une séquence KanaR qui lui confère donc une résistance à la kanamycine 

pPACES possède une séquence AmpiR qui lui confère une résistance à l'ampicilline 

On en déduit quoi ? En présence de kanamycine, les bactéries qui auront intégré le plasmide pCK-CXCL1 vont survivre mais les bactéries qui auront intégré le plasmide pPACES (avec ou sans l'insert) vont mourir 

En présence d'ampicilline, les bactéries qui auront intégré le plasmide pCK-CXCL1 vont mourir mais les bactéries qui auront intégré le plasmide pPACES (avec ou sans l'insert) vont survivre 

 

Donc si tu mets à la fois de l'ampicilline et de la kanamycine, tu vas tuer toutes les bactéries donc tu ne verras rien 

Item B faux 

 

C) Les digestions enzymatiques vont te donner des fragments de tailles différentes (ici on ne vous donne pas de carte précise avec les tailles entre les différents éléments plasmatiques donc tu ne pourrais pas deviner la taille) qu'on va ensuite faire migrer sur un gel pour voir si le plasmide obtenu in fine est recombinant ou non (recombinant = qui a intégré l'insert d'intérêt, ici CXCL1)

 

Je te conseille de dessiner à chaque fois ce que tu obtiens après intégration de l'insert dans le plasmide

Tu obtiens donc le plasmide suivant : 

(fais attention les deux photos sont différentes, tu vois les deux sens s'insertion possibles) 

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/8k24.jpeg

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/3oou.jpeg

(en noir les structures de pPACES, en rose les enzymes de restriction de pPACES, en vert l'insert provenant de pCK-CXCL1)

 

Tu remarques donc que l'enzyme de restriction est présente à la fois dans le plasmide pPACES de départ (= non recombinant = en noir) et aussi dans l'insert (en vert) 

Donc si tu digères pPACES non recombinant par Pte1 -> tu vas linéariser ton plasmide 

Si tu digères pPACES recombinant par Pte1 -> vas vas obtenir 2 fragments de tailles particulières (non connues ici) et ton plasmide pPACES recombinant aura forcément une taille totale plus grande que le plasmide pPACES non recombinant puisqu'on a ajouté l'insert qui a une taille précise (non donnée ici)

D'autre part, tu vois que Pte1 sur l'insert est situé près de BamH1 (de gauche) donc le nombre nucléotides entre Pte1 (en noir) et Pte1 (en vert) pourra être déterminé et sera inférieur au nombre de nucléotides entre Pte1 (en noir) et Pte1 (en vert) si on met l'insert dans l'autre sens (cf les deux photos)

Item C vrai 

 

D) Comme le tag His est sous le contrôle du promoteur eucaryote constitutif au même titre que l'insert CXCL1, alors effectivement il faut que les séquences soient en phase 

On parlera alors de fusion traductionnelle

Item D vrai 

 

E) La sécrétion se fait par les cellules eucaryotes (cf énoncé)

Item E faux 

 

Donc pour récapituler : les réponses vraies sont CD

[Cassolnousmanque2]

Il y a 1 heure, PEPETTE a dit :

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/sze1.png

 

Je vous mets plutôt cet exemple (qui vient du poly) pour la taille la D est juste et je n'arrive pas à comprendre d'où sort 1300; 630 et 670

Par rapport à ça

Je reprends seulement l'item D qui te pose problème (si jamais tu as d'autres questions pour ABC et E n'hésite pas)

On va utiliser BamH1 et Xho 1300 - 670 = 630 pb (ici tu calcules la distance entre les deux enzymes de restriction comme si tu calculais une distance)

Ensuite tu calcules la taille du plasmide recombinant (= celle du vecteur d'expression + celle de l'insert = 6200 + 630 = 6830 pb)

Or, comme tu le vois, on insère entre BamH1 et Xho1, donc tu vas supprimer la séquence du plasmide non recombinant entre ces deux enzymes de restriction (pareil tu calcules la distance : 1400 - 1350 = 50 pb)

Donc tu calcules la taille finale du vecteur d'expression : 6830 - 50 = 6780 pb

C'est plus clair pour toi ?

[PASSionée]

Il y a 4 heures, Cassolnousmanque2 a dit :

Par rapport à ça

Je reprends seulement l'item D qui te pose problème (si jamais tu as d'autres questions pour ABC et E n'hésite pas)

On va utiliser BamH1 et Xho 1300 - 670 = 630 pb (ici tu calcules la distance entre les deux enzymes de restriction comme si tu calculais une distance)

Ensuite tu calcules la taille du plasmide recombinant (= celle du vecteur d'expression + celle de l'insert = 6200 + 630 = 6830 pb)

Or, comme tu le vois, on insère entre BamH1 et Xho1, donc tu vas supprimer la séquence du plasmide non recombinant entre ces deux enzymes de restriction (pareil tu calcules la distance : 1400 - 1350 = 50 pb)

Donc tu calcules la taille finale du vecteur d'expression : 6830 - 50 = 6780 pb

C'est plus clair pour toi ?

hello ! 

moi j'arrive pas trop a comprendre la E :/ si ca te déranges pas d'expliquer stpp

merci d'avance :)

[Cassolnousmanque2]

@PASSionéePas de soucis,

Alors j'ai expliqué ici pourquoi on ne pouvait utiliser QUE BamH1 et Xho1 (je te laisse aller voir l'explication)

https://forum.tutoweb.org/topic/86389-taille-du-plasmide/#comment-460677

 

Et comme tu as 2 enzymes de restriction différentes et non complémentaires, alors tu as un clonage orienté, donc l'insert ne peut se mettre que dans un seul sens dans le plasmide 

voila le schéma de ce qu'on obtient in fine https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/2htc.jpeg (en bleu foncé le plasmide d'origine, en bleu clair l'insert)

 

Tu visualises mieux ? 

 

[PASSionée]

@Cassolnousmanque2

okay je commences a comprendre 

juste j'ai du mal avec la notion d'enzyme de restriction complémentaire ( je comprend pas comment on sait que c'est complémentaire ou non ) 

en tout cas merci beaucoup pour le temps que tu prend a répondre a nos questions !! (ca doit te prendre bcp de temps…) 

[Cassolnousmanque2]

il y a 6 minutes, PASSionée a dit :

juste j'ai du mal avec la notion d'enzyme de restriction complémentaire ( je comprend pas comment on sait que c'est complémentaire ou non ) 

Si on ne te donne pas les séquences des enzymes de restriction, alors tu dois partir du principe que si tu as 2 enzymes différentes, alors tu auras un clonage orienté

Tel quel, dans l'énoncé, avec vos connaissances tu ne pourrais pas le deviner ;)  

 

[PEPETTE]

@Cassolnousmanque2 désolée d'encore te solliciter... mais je ne comprends pas l'item D pourquoi il est faux? comment savoir (dans l'énoncé ils disent simplement tissu spécifique) et dans la correction on parle de cardiomyocyte..?

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/ya0c.png

[barbiedocteur]

Salut @PEPETTE!!

On ne te parle en effet dans l'énoncé que de promoteur tissu spécifique inséré devant l'ADNc de la GFP, donc théoriquement tu ne peux pas savoir spécifique de quel tissu avec l'énoncé seul. Mais sur le schéma de ton plasmide, devant l'ADNc de la GFP tu peux voir que le promoteur eucaryote est cardiomyocytes spécifique ;) Donc l'item D est bien faux

N'hésite pas si il y a autre chose !

[PEPETTE]

Super merci pour ton retour, 

Pourrais tu m'éclairer sur les termes plasmides recombinant et non recombinant je n'arrive pas à savoir si j'ai deux figures laquelle des deux correspond 

[Cassolnousmanque2]

@PEPETTE, 

Alors le plasmide non recombinant c'est le plasmide que tu as AVANT l'insertion de la séquence d'intérêt 

Le plasmide recombinant c'est le plasmide que tu obtiens APRES l'insertion de la séquence d'intérêt

 

Le plasmide qu'on te donne dans le dernier qcm que tu nous as partagé est le plasmide recombinant puisqu'on te dit que l'insertion du promoteur tissu spécifique et de la GFP a déjà été réalisée

 

 

[camhile]

@Cassolnousmanque2 coucouuu, merci pour ta super explication qui m'a aidée sur pleins de points! j'ai juste du mal avec la C (une des deux photos ne marche pas d'ailleurs je sais pas si ça a un impact sur ton explication). 

En fait pour la C je comprend pas pourquoi elle est juste alors que Pte1 sur la plasmide pPACES ne se trouve pas dans la zone du promoteur eucaryote... je croyais qu'il fallait toujours regarder ça dans les qcms donc je suis un peu perdue ... et que signifie sens d'insertion stp? je crois que c'est ça qui m'embrouille un peu 

[Cassolnousmanque2]

@camhile, c'est quelle photo qui ne fonctionne pas ? Parce que personnellement j'arrive à ouvrir les deux ...

Je te les remets ici au cas où ça marcherait mieux : 

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/8k24.jpeg

https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/3oou.jpeg

 

En fait si tu arrives à ouvrir les photos, tu verras que tu obtiens 2 plasmides différents (fais bien attention à la séquence verte, tu verras qu'elle n'est pas dans le même sens)

il y a 26 minutes, camhile a dit :

En fait pour la C je comprend pas pourquoi elle est juste alors que Pte1 sur la plasmide pPACES ne se trouve pas dans la zone du promoteur eucaryote... je croyais qu'il fallait toujours regarder ça dans les qcms donc je suis un peu perdue ... et que signifie sens d'insertion stp? je crois que c'est ça qui m'embrouille un peu 

Pour la deuxième partie de ta question, avec la photo c'est plus compréhensible je trouve donc déjà dis moi si tu arrives à les ouvrir maintenant ou si ça ne marche toujours pas, 

Après j'essayerai de t'expliquer au mieux 

 

Pour le sens d'insertion, j'ai essayé de te faire ce schéma là, https://zupimages.net/viewer.php?id=23/01/lmrr.jpeg

à gauche tu vois que le 1 est à l'endroit et à droite il est à l'envers 

[camhile]

@Cassolnousmanque2 c'était la 2ème mais là c'est bon! merci bcp pour ta réponse, j'ai fait une petite pause je reviendrai sur ce chapitre un peu plus tard parce que là je saturais mdr mais je reviens vers toi des que je me repenche dessus 

[camhile]

@Cassolnousmanque2 coucou c'est moi de nouveau, j'ai repris ton explication avec les schémas et je crois que j'ai compris!

par contre en fonction du sens dans lequel on met le plasmide, l'item reste quand même vrai?

parce qu'en fait quand on met l'insert dans ce sens https://www.zupimages.net/viewer.php?id=23/01/3oou.jpeg , j'ai l'impression que ça s'arrête au niveau de l'endroit ou il y a Pte1 sur le plasmide en vert et que du coup la digestion du reste du plasmide ne peut pas se faire. Alors que dans l'autre sens si, comme ça Pte1 est sur la fin du plasmide et ça bouge pas.  Je crois que je me mélange un peu les pinceaux avec le génome et je vois les enzymes comme un codon d'initiation et un codon stop alors que rien à voir 

du coup pour récapituler, peu importe ou se situe l'enzyme Pte1, à partir du moment ou elle est sur le plasmide c'est bon ou il faut prendre en compte de sa position sur l'insert aussi?

Edited January 6, 2023 by camhile

[Cassolnousmanque2]

Coucou @camhile,

il y a 24 minutes, camhile a dit :

parce qu'en fait quand on met l'insert dans ce sens https://www.zupimages.net/viewer.php?id=23/01/3oou.jpeg , j'ai l'impression que ça s'arrête au niveau de l'endroit ou il y a Pte1 sur le plasmide en vert et que du coup la digestion du reste du plasmide ne peut pas se faire. Alors que dans l'autre sens si, comme ça Pte1 est sur la fin du plasmide et ça bouge pas.  Je crois que je me mélange un peu les pinceaux avec le génome et je vois les enzymes comme un codon d'initiation et un codon stop alors que rien à voir 

Oui je crois aussi que tu t'es mélangée

En fait si tu veux les sites de restriction c'est juste des enchaînements particuliers de nucléotides A, T, C et G (souvent par 6), ça n'a rien à voir avec la traduction, les codons initiateurs et les codons STOP 

C'est juste un endroit précis du génome sur lequel les enzymes de restriction (qui sont des ENDOnucléases) vont pouvoir réaliser une coupure de l'ADN

Quand on te demande si on pourra déterminer le sens d'insertion en réalisant des digestions enzymatiques c'est parce qu'en fait après on va faire migrer les fragments d'ADN sur un gel d'électrophorèse

En fonction de la taille des fragments obtenus, on pourra déterminer dans quel sens le fragment s'est inséré 

il y a 28 minutes, camhile a dit :

du coup pour récapituler, peu importe ou se situe l'enzyme Pte1, à partir du moment ou elle est sur le plasmide c'est bon ou il faut prendre en compte de sa position sur l'insert aussi?

Alors c'est pas vraiment peu importe , ça peut dépendre de sa position (si le site est pile au milieu de la séquence insérée) mais ça devient plus compliqué

Dans le cas du qcm dont on parle là, comme PteI n'est pas situé pile au milieu de la séquence insérée, alors ça ne pose pas de problème

[camhile]

@Cassolnousmanque2 d'accord merci bcp, oui je fais des mix de notions C'est chiant bon je vais plus réfléchir comme ça alors ! mais dans la globalité j'ai compris manque plus que de l'entraînement j'espère! 

j'ai aussi une question par rapport à un qcm d'annale,  un item qui revient assez fréquemment et je suis bloquée à chaque fois...je pense que je vais lancer un autre sujet du coup (je vous encore vous embêter les tuteurs je suis désolée)

[Cassolnousmanque2]

Il y a 1 heure, camhile a dit :

je pense que je vais lancer un autre sujet du coup (je vous encore vous embêter les tuteurs je suis désolée)

Pas de soucis on est là pour vous aider !!