Méthode Sanger

[CHACOTTE]

Bonjour ! 

 

Je ne comprends pas bien la méthode de Sanger...

Pourquoi y a t-il moins de ddNTP que de dNTP ?

Et dans ce contexte, comment pouvons nous connaitre la séquence si il y a des dNTP qui sont insérés et qui n'arrêtent pas la  séquence ?

Merci de m'éclairer ! 

[JulieFinkel]

Salut

 

Tu as bien raison de demander conseil parce que cette méthode est super importante et il est primordial de bien l'avoir comprise.

 

Cette technique permet le séquençage du génome, elle a été extrêmement utilisée pendant un temps, mais maintenant on l'utilise moins car on a des techniques beaucoup plus avancées. 

 

Premier point à savoir pour bien comprendre cette méthode, c'est qu'un didesoxy-NTP (que ce soit un ddATP, ddGTP, ddCTP ou ddTTP) va bloquer l'élongation lorsqu'il sera incorporé dans l'ADN car il ne possède pas de OH en 3' (c'est pour ça qu'on dit qu'il est "di-desoxy" : il n'a pas de OH en 5' ni en 3'), et que ce OH en 3' est indispensable pour effectuer la liaison phosphodiester entre le OH en 3' d'un (désoxy)nucléotide et le P en 5' du suivant.

Bref, didesoxy = pas de OH en 3' = pas de liaison phosphodiester = arrêt de l'élongation.

 

Le principe général de cette technique est de reconnaître des molécules en cours d'élongation. En fait, tu vas avoir un ADN que tu veux séquencer car tu ne connais pas sa séquence (donc comme c'est un ADN, il est double brin (à moins que ce soit un ADNc évidemment)). Sauf que la technique de Sanger repose sur le fait que tu vas détecter quelle base s'apparie à quel endroit avec ton ADN matrice (celui que tu veux séquencer), et donc tu vas te dire par exemple "Ok si un T s'est apparié à tel endroit avec le brin matrice, alors il y avait un A sur la matrice". Sauf que pour que l'appariement se fasse il faut que tu aies un ADN simple brin (logique), et donc tu vas dénaturer ton ADN double brin afin d'en avoir un simple brin.

 

Donc tu vas effectuer une réaction d'élongation. Sauf que comme pour toute réaction d'élongation, l'ADN pol va avoir besoin d'une amorce. Tu mets ton ADN simple brin dans un vecteur, et tu synthétises une amorce qui pourra aller s'apparier avec ton vecteur (vecteur dont tu connais parfaitement la séquence). Ainsi, l'amorce va aller s'hybrider avec le vecteur (simple brin bien sûr, vu qu'il faut que l'amorce s'hybride) avant la zone où est inséré l'ADN que tu veux séquencer. Donc la réaction d'élongation qui se fera à partir de l'amorce permettra de séquencer l'ADN dont tu veux justement connaître la séquence (je vais m'expliquer en détails plus tard).

 

Cependant, il faut qu'une fois ton élongation faite tu puisses détecter le fragment que tu viens d'obtenir. Pour le détecter, on peut utiliser la radioactivité mais on utilise préférentiellement la fluorescence. En effet, la radioactivité coûte cher, émet des déchets radioactifs etc., bref ce n'est pas le top. Donc pour détecter tes fragments tu vas avoir besoin qu'ils soient marqués par un fluorophore. Où place-t-on ce fluorophore ?

- On ne peut pas utiliser de dNTP fluorescents car le fluorophore est tellement gros que ça bloquerait l'élongation à chaque fois qu'un dNTP fluorescent serait incorporé, et donc on aurait toujours à peu près le même type de fragments, ce qui ne nous permettrait pas de conclure (tu vas comprendre plus loin).

- On peut marquer l'amorce avec un fluorophore

- On peut marquer les ddNTP avec un fluorophore, car de toutes façons le ddNTP va arrêter l'élongation alors la taille du fluorophore n'est pas un problème.

 

Maintenant, on va mettre ensemble le vecteur contenant l'ADN à séquencer, l'amorce (qui va aller s'apparier avec le vecteur juste avant l'ADN à séquencer), l'ADN pol I, des dNTP (dGTP, dCTP, dTTP et dATP), et les ddNTP (ddGTP, ddCTP, ddTTP, et ddATP). Et on va faire la réaction d'élongation !

Qu'est ce qu'on obtient ?

- Si on a un A sur la matrice : on va avoir appariement soit d'un dTTP (auquel cas l'élongation continuera), soit d'un ddTTP (auquel cas l'élongation s'arrêtera).

- Si on a un C sur la matrice : on va avoir appariement soit d'un dGTP (auquel cas l'élongation continuera), soit d'un ddGTP (auquel cas l'élongation s'arrêtera).

- Si on a un G sur la matrice : on va avoir appariement soit d'un dCTP (auquel cas l'élongation continuera), soit d'un ddCTP (auquel cas l'élongation s'arrêtera).

- Si on a un T sur la matrice : on va avoir appariement soit d'un dATP (auquel cas l'élongation continuera), soit d'un ddATP (auquel cas l'élongation s'arrêtera).

On rajoute toujours plus de dNTP que de ddNTP car si on avait par exemple énormément de ddTTP et très peu de dTTP alors quand il y aura un A sur la matrice il y aurait préférentiellement incorporation d'un ddTTP et l'élongation s'arrêterait quasi-systématiquement au premier "A" trouvé sur la matrice et ne continuerait pas assez pour "trouver" tous les A sur la matrice car quasi-tous nos fragments synthétisés arrêteraient leur élongation au premier "T" incorporé.

 

Grâce à tout ça, tu vas obtenir des fragments de différentes tailles (car tous les ddNTP ne vont pas s'insérer au même endroit et donc l'élongation ne s'arrêtera pas toujours au même endroit). C'est ce qui est représenté sur tes diapositives 128 et 129 (du poly de cette année).

 

Arbitrairement, tu auras attribué une couleur différente à chaque ddNTP. Par exemple (l'exemple de Langin dans son cours) le ddATP sera marqué en vert, le ddCTP en bleu, le ddGTP en noir, et le ddTTP en rouge. Donc tu vas avoir des fragments de différentes tailles et de différentes couleurs.

 

Si par exemple tu vois que tu as un fragment de 9 bases vert alors tu pourras en déduire que la dernière base de ce fragment est un A car c'est un ddATP qui a été incorporé en dernier et qui a causé l'arrêt de l'élongation. Donc cela veut dire que sur le brin matrice tu avais un "T" à cet endroit. Cependant, comme les brins d'ADN sont antiparallèles et que la synthèse/l'élongation des brins se fait toujours de 5' vers 3', alors si tu as un fragment de 9 bases (amorce comprise) se terminant par un A, cela signifie que sur le brin matrice (à séquencer) la 9e base en partant du 3' était un T !

Ainsi, si tu obtiens également un fragment de 10 bases vert alors tu peux en déduire que sur le brin matrice la 10e base en partant du 3' était un T.

Si tu obtiens en plus un fragment de 11 bases vert alors sur le brin matrice la 11e base en partant du 3' était un T.

Si tu obtiens encore en plus un fragment de 12 bases rouge alors tu peux en déduire que sur le brin matrice la 12e base en partant du 3' était un A (vu qu'on a marqué au rouge les ddTTP et que le T s'apparie avec le A).

Et tu continues pour tout le brin !

 

Evidemment, on ne va pas s'amuser à faire ça "manuellement" (ce serait vraiment galère). En fait ce qu'il se passe, c'est qu'une fois que tu as fait toutes tes réactions d'élongation et que tu as donc plein de fragments de différentes couleurs et de différentes tailles, tu mets tout ça dans un séquenceur automatique. Un séquenceur automatique est un appareil dans lequel on fait un électrophorèse capillaire (et oui même Domi fait des électrophorèses capillaires   #blaguedegénomepurpanais), c'est à dire qu'on a des tubes très fins (de la taille d'un cheveux justement) qui permettent grâce à une pression extrêmement élevée de séparer des molécules ayant comme seule différence une taille d'un (désoxy)nucléotide. Ainsi, on a séparé par la taille tous les fragments d'ADN venant d'être synthétisés. On a donc tous ces fragments "dans le bon ordre" de taille. Comme ces fragments sont fluorescents d'une couleur différente (selon quel ddNTP a arrêté l'élongation) alors on fait passer le tout devant une caméra qui détecte la fluorescence émise et la traduit en couleur donnée, donc différente selon le ddNTP. Or on a "dit" à l'ordinateur quelle couleur on avait attribué à quelle ddNTP et donc l'ordinateur nous sort un fichier texte avec toutes les bases dans le bon ordre, selon la couleur détectée    (et c'est dans le bon ordre vu qu'on a classé les fragments par taille grâce à l'électrophorèse capillaire).

 

Bref, on se retrouve avec le schéma que Domichou vous a filé (diapo 130 sur le poly de cette année) où on a plein de pics et sous chaque pic on a une lettre. Attention, info super méga importante qui est LE truc à retenir pour les QCM : CHACUN DE CES PICS CORRESPOND A UN FRAGMENT FLUORESCENT DETECTé, ET DONC CHACUN DE CES PICS CORRESPOND A L'INCORPORATION D'UN DDNTP ET DONC A UN ARRET D'ELONGATION !!!!!!!!!!

Voilà, au moins vous ne pourrez pas dire qu'on vous avait pas prévenus  . J'insiste comme ça car il y a des QCM là-dessus, et si vous n'avez pas très bien compris cette notion vous risquez de vous planter et prendre des points négatifs sans même vous en apercevoir  (pour ceux qui veulent s'entraîner, ce sont des QCM du concours de Janvier 2015, on les a corrigés sur le forum mais si vous ne comprenez pas quelque chose qui n'a pas été expliqué n'hésitez pas à nous faire signe ).
 

Enfin, petite conclusion : la méthode de Sanger est une méthode de séquençage de bas débit (contrairement au pyroséquençage) qui permet la lecture de fragments jusqu'à 600-700 bases. Elle est très utile pour trouver des mutations dans la séquence codante engendrant certaines maladies (comme certains diabètes par exemple). Pour voir ce type de mutations on fait un séquençage de tous les exons du patient suspecté d'être atteint par la maladie génétique en question.

 

Voilà, j'espère que tu (et tous ceux qui liront ce post) as bien compris, et surtout j'espère avoir été claire, n'hésite pas à me le dire si ce n'est pas le cas ou si il persiste des incompréhensions .

 

Avec Domi il est primordial de très bien avoir compris les techniques et de faire un max d'annales !

 

Bon courage pour la suite .

[CHACOTTE]

Merciiiiiiiiiiii ! Vraiment c'est super gentil d'avoir pris le temps d'expliquer aussi précisément ! 

Tout est beaucoup plus clair !