résistance plasmide

[Cat]

Coucou une  question suite à une colle où on ne m'a jamais répondu (jsp si c'est seulement pour les PASS les discussion) et suite au concours blanc d'auj: QCM2 item E, pour voir si les cellules euc ont bien été transduite par le plasmide, en plus du fait qu'il faut un promoteur euc, il ne faudrait pas non plus que je gène de résistance soit sur la séquence d'ADNc intégré dans le plasmide? Afin de montrer que c'est le BON plasmide avec l'ADNc ? 

merci bcp !

[Alievna]

Salut ! Au QCM 2 on transfecte tout le plasmide dans les cellules de la souris donc toutes les séquences du plasmide ayant un promoteur euc seront exprimées dans les cellules de la souris y compris ADNc qu'on a intégré. Donc non ce n'est absolument pas nécessaire que le gène de résistance soit sur la séquence d'ADNc intégré dans le plasmide, qui elle code déjà une autre prot : la GFP. Sinon pour vérifier que les cellules ont bien été transduite dans les cellules on peut utiliser le G418 (qui lui possède un promoteur euc) ayant une séquence de résistance sur le plasmide.

J'espère avoir répondu à ta question :)

[Cat]

Merci déjà pour cette rep mais en fait c'est plus dans le sens, si on nous demande de vérifier que c'est 1 le bon plasmide (il suffit donc que ce plasmide ait un gène de résistance précédé d'un promoteur euc) qui a été introduit dans la bactérie mais aussi 2 que ce plasmide contient bien l'ADNc qu'on veut faire exprimer, et donc il faudrait que le gène de résistance se trouve sur la séquence de l'ADNc ajouté pour le prouver?

Jsp si je suis claire ?

En fait de vérifier que c'est pas le bon plasmide mais "vide" par exemple, et pour moi la question, qui reviens souvent nécessite les deux, mais je me trompe possiblement ?

[Alievna]

Ah d'accord je comprend mieux ta question !

Si tu veux vérifier que ton plasmide possède bien l'ADNc tu peux faire un Western Blot, tu compares des cellule de souris qui n'ont pas été transfecté avec ceux transfecté par le plasmide grâce à des ac contre la protéine codé par l'ADNc, et normalement t'as une tâche sur le gel d'électrophorèse qui correspond à cette protéine pour la cellule transfecté qui montre qu'elle exprime bien cette protéine donc que le plasmide a bien intégré le fragment et qu'il n'est pas vide.

Révélation

Après je pense pas que tu puisses trier un à un tes plasmides pour voir lequel est vide ou non pour une cellule eucaryote, ça serait compliqué et chiant (peut-être je me trompe hein).

 

Edited February 27, 2022 by Alievna

[Cat]

Oki merci et du coup si on nous parle de cette résistance aux antibio, on doit pas s'assurer que le gène est sur l'ADNc mais seulement sur le plasmide avec un promoteur euc?

[Alievna]

il y a 8 minutes, Cat a dit :

Oki merci et du coup si on nous parle de cette résistance aux antibio, on doit pas s'assurer que le gène est sur l'ADNc mais seulement sur le plasmide avec un promoteur euc?

Là dans la question du qcm, on sait déjà que la résitance à la kanamycine est présente sur le plasmide pGFP mais on veut vérifier que le plasmide (avec l'ADNc ou non) est bien intégré dans les cellules c'est pour ça qu'on veut mettre les cellules en présence de kanamycine pour voir lesquelles résistent et donc voir si le plasmide a bien été transfecté dans les cellules (évidemment on aura aucune résistance car c'est un promoteur proc) mais on peut faire l'expérience avec le G418 qui lui a un promoteur euc donc ça permettra de sélectionner les cellules transduites des non transduites.

Si la séquence qu'on voulait transférer dans un plasmide était la résistance alors là, on devrait s'assurer que cette résistance est bien sur la plasmide.

[Mey]

Comme l'a expliqué @Alievna, ici le but de l'expérience est de vérifier si les cellules ont été transduites avec le plasmide et non pas de vérifier si le plasmide a intégré la séquence voulue! Effectivement il aurait fallu un promoteur eucaryote constitutif donc l'item est faux. Effectivement tu ne peux pas être sur que ton plasmide contient la séquence transduite, pour en être sur tu peux utiliser une résistance à un deuxième antibiotique (pas au programme).

Voici les infos que j'ai trouvé sur ce site: http://genet.univ-tours.fr/gen001300_fichiers/CHAP5D/GEN05D1EC35A.HTM:

"La transformation d'une bactérie sensible à un antibiotique par des plasmides portant un gène de résistance au même antibiotique aboutit à l'apparition d'une résistance uniquement pour les bactéries ayant incorporé les plasmides.
Cette technique permet de séparer les bactéries comportant des plasmides et les bactéries sans plasmides car ces dernières sont tuées. Cependant, elle ne permet pas de distinguer les bactéries avec plasmides intacts des bactéries avec plasmides recombinants. On utilise pour cela une résistance à un second antibiotique, par exemple: une tétracycline.
L'insertion du fragment d'ADN dans le plasmide doit inactiver le gène de résistance au deuxième antibiotique. Les bactéries transformées par les plasmides recombinants sont donc résistantes au premier antibiotique (ampicilline) et sensibles au deuxième antibiotique (tétracycline). Les bactéries non transformées sont sensibles aux deux antibiotiques."