cytométrie en flux

[une_PASSionnée]

heyy, 

je ne comprends pas trop cette partie du cours : ça concerne la cytométrie en flux 

Marquage d’Ag membranaires (CD4 et CD8) et d’Ag intracellulaires (cytokine: IFNg)

(i) Stimulation polyclonale (4h) (PMA/ionomycine + bréfeldine A)

(ii) Marquage anti-CD4+anti-CD8

(iii) Fixation/perméabilisation +anti-IFNg

(iv) Cytométrie en flux

 

merci

[PASSlesrep]

technique de cytométrie en flux permet de quantifier les Antigène membranaires (CD4 pour les LT auxiliaires et CD8 pour les LT cytotoxiques) et intracellulaires (INF gamma). Les cytokines sont produites par des cellules de l’organisme, elles sont sécrétées dans l’environnement extra-cellulaire. On utilise un artifice technique qui permet d’éviter la sécrétion des cytokines: elles s’accumulent dans le cytoplasme.

On utilise la Bréfeldine A qui bloque la sécrétion de protéines et donc de faciliter leur accumulation dans le cytoplasme. On réalise une stimulation polyclonale avec du PMA (ester de formol, analogue du DAG) et de la ionomycine (calcium ionophore: c’est une molécule qui peut s’insérer au niveau de la MP des lymphocytes et qui facilite l’entrée de calcium dans les lymphocytes. En utilisant ces molécules on mime l’activation du LT par la stimulation du TCR (qui mobilise la PKC, le calcium extra-cellulaire entre
dans les cellules...). On réalise ensuite un marquage avec un Anticorps anti CD4 (fluorochrome d’une couleur), et anti CD8 d’une autre couleur, on fixe les cellules, on les perméabilise et on ajoute un Anticorps anti-IFN, puis on réalise la cytométrie en flux. Généralement on a une fenêtre qui permet de déterminer le pourcentage de Lymphocytes qui produisent de l’interféron γ.

-> tiré d'un cours de PACES. 

[une_PASSionnée]

merci c plus cliar