localisation des protéines

[31100.pdf]

 

 

Slt !

 

Je n'ai pas très bien compris ce que représente le schéma de droite dans le cours 

 

"- Protéine surexprimée (expression ectopique) : Anticorps spécifiques de la protéine ou utilisation de protéines étiquetées avec des anticorps contre les étiquettes, ou étiquettes fluorescentes

Expérience d’immunomarquage directe ou indirecte observées en MICROSCOPIE "

 

 

 

1-anticorps marqué  2- anticorps secondairement       3- ????

(marquage direct)    marquées ( marquage indirect)

 

J'ai aussi une autre question : pourquoi nous mettons une sonde constante d'actine ( elle permet quoi exactement ) lors des western-blot ?

 

merci d'avance 

[Pitchounou]

Salut @N31100 ! 

 

Je ne suis pas sur d'avoir entièrement compris ta première question, si j'ai bien compris tu te poses la question de savoir ce que représente l'image avec le Pacman vert ? 

Tout est dans la phrase que tu as écrite en italique !

Le premier dessin c'est bien un simple anticorps reconnaissant la protéine. Le deuxième c'est un marquage indirect comme tu l'as dit.

Le 3ème, le fameux, c'est en fait une protéine (le truc vert) étiquetée (la boule rouge), avec un anticorps anti-étiquette qui reconnaît donc la boule rouge. 

 

Par rapport à ta deuxième question, la sonde d'actine est une sonde "test", c'est ce qu'on appelle un témoin de charge.

Tu sais que le Western Blot est une méthode semi-quantitative utilisée notamment pour mesurer la concentration de protéine dans un échantillon, de part l'épaisseur de la bande : plus la bande est épaisse plus il y a de protéine.

Mais lorsque tu fais ta manip, qu'est ce qui nous dit que tu as déposé la même quantité de protéine dans chaque échantillon ? Qu'est ce qui nous dit qu'il y a vraiment plus de telle protéine dans l'échantillon 1 par exemple, et pas simplement que tu as moins chargé de protéine dans l'échantillon 2.

Alors on utilise une sonde d'actine.

L'actine est présente dans toutes les cellules, et en quantité élevée.

Le niveau d'expression de l'actine, soit la bande, doit être le même dans tous les échantillons, permettant ainsi de vérifier qu'on a bien chargé la même quantité de protéines et qu'elles ont été adéquatement transférées sur la membrane.

 

Si les bandes sont différentes on sait que c'est un problème de manip, et pas une réelle différence entre les échantillons. 

 

Ca marche pour toi ? 

[31100.pdf]

merci beaucoup pour ta réponse détaillée !

 

mais du coup dans le 3ème schéma , la protéine est fluorescente ( par GFP je suppose ) mais du coup sa sert à quoi de l'étiquetter et d'utiliser un anticoprs anti-étiquette ?

 

merci d'avance 

[IceTea]

 

Il y a 2 heures, N31100 a dit :

merci beaucoup pour ta réponse détaillée !

 

mais du coup dans le 3ème schéma , la protéine est fluorescente ( par GFP je suppose ) mais du coup sa sert à quoi de l'étiquetter et d'utiliser un anticoprs anti-étiquette ?

 

merci d'avance 

 

Salut, 

 

L'étiquette permettra éventuellement de purifier la protéine.

[31100.pdf]

il y a 8 minutes, IceTea a dit :

 

 

Salut, 

 

L'étiquette permettra éventuellement de purifier la protéine.

Slt !

merci pour ta réponse .

j'ai pas vraiment très bien  compris ce que tu voulais dire ...  Parce que le but de la diapo c'est de montrer comment on localise les prot , mais du coup comme la prot est fluo et donc localisable , pourquoi a t -on rajouter une étiquette et un anticorps 

 

merci d'avance

[Pitchounou]

Il y a 3 heures, N31100 a dit :

dans le 3ème schéma , la protéine est fluorescente ( par GFP je suppose ) mais du coup sa sert à quoi de l'étiquetter et d'utiliser un anticoprs anti-étiquette ?

 

Rien ne te dit que la protéine est fluorescente, il existe un grand nombre d'étiquettes, 6-His par exemple, qui ne sont pas fluorescentes.

Dans ce cas-là, et c'est ce que la phrase que tu as recopié en italique dit, on utilise un anticorps anti-étiquette qui lui est marqué. 

 

En gros soit tu utilises des étiquettes fluorescentes soit tu utilises des étiquettes non fluorescentes marquées par des anticorps qui eux sont marqués (fluorescents par exemple). Tu vois ce que je veux dire ? 

[31100.pdf]

 oui je viens de comprendre mdrr . Mais  les étoiles violettes sont sur la prot dans le schéma  ?

[Pitchounou]

il y a 10 minutes, N31100 a dit :

Mais  les étoiles violettes sont sur la prot dans le schéma  ?

Ah ben oui tiens d'ailleurs je viens de le voir, je pense que ce schéma 3 représente les 2 aspects de la phrase en même temps "utilisation de protéines étiquetées avec des anticorps contre les étiquettes, ou étiquettes fluorescentes". 

Le schéma est peut être un peu mal fait, ne te casse pas la tête le plus important à retenir c'est que les étiquettes peuvent être fluorescentes, ou on peut utiliser des anticorps anti-étiquettes marqués, soit directement (1 seul anticorps) soit indirectement (2 anticorps). Si t'as compris ça c'est tout bon ! 

Edited January 22, 2022 by Pitchounou

[IceTea]

Il y a 18 heures, N31100 a dit :

Slt !

merci pour ta réponse .

j'ai pas vraiment très bien  compris ce que tu voulais dire ...  Parce que le but de la diapo c'est de montrer comment on localise les prot , mais du coup comme la prot est fluo et donc localisable , pourquoi a t -on rajouter une étiquette et un anticorps 

 

merci d'avance

 

Salut,

Comme tu le dis, on peut localiser la protéine avec la fluorescence, mais pour la purifier, c'est à dire obtenir un échantillon de cette même protéine et uniquement celle-ci, on va utiliser l'étiquette.

[31100.pdf]

Merci à vous deux !