Immunoprécipitation lysat

[Juju_turtle]

Coucou, 

Je comprends pas à quoi correspond le lysat dans les techniques d'immunoprécipitation,

dans l'exemple de la prof g compris que la protéine vif s'exprimait uniquement lorsqu'il y a des MDM2 https://zupimages.net/viewer.php?id=22/03/lal2.png mais pourquoi sur le lysat on obtient la protéine vif même si il n'y a pas de MDM2 et donc un résultat différent de IP ? 

Merci d'avance à la personne qui prendra le temps de m'expliquer :)

[Pitchounou]

Salut @Juju_turtle! 

Je me rappelle qu'il y avait eu des confusions sur la notion de lysat cellulaire l'année dernière ! Le lysat en gros c'est ce que tu obtiens quand tu utilises des dissolvants sur tes échantillons. C'est le produit d'une "lyse". Donc dans ce lysat on a toutes les protéines que contenait la cellule notamment. 

 

Reprenons ensemble cet exemple. 

On a pris des cellules, on a utilisé des détergents/dissolvants et on a obtenu des extraits cellulaires (en fait ça nous permet d'avoir accès aux protéines tout simplement)

On fait un Western Blot à partir de ces extraits. Maintenant on interprète le tableau 

 

• Commençons par la ligne "lysat cellulaire". Cette ligne te permet juste de confirmer ce qui est écrit au dessus c'est à dire que dans la première piste on a MDM2 et VIF, et dans la deuxième seulement VIF (ce qui est notifié par MDM2 + ou - et VIF +). Ce n'est pas celle-là qui est la plus intéressante 

 

• La plus intéressante c'est la ligne au-dessus, l'immunoprécipitation. Lorsqu'on immunoprécipite avec un anticorps anti-MDM2 on remarque que dans la piste MDM2 + (donc en présence de MDM2) on a une bande correspondant au MDM2, c'est logique. Mais on remarque qu'on a également une bande VIF. Or pour immunoprécipiter on n'a pas utilisé un anticorps anti-VIF, donc si on en a récupéré c'est forcément que VIF interagissait avec MDM2, et en récupérant ce MDM2 on a également récupéré VIF. Cela explique les 2 bandes sur la première piste. La deuxième piste est une piste contrôle, on vérifie bien que VIF n'interagit pas simplement avec la bille par exemple (en fait c'est un test ou l'on met simplement VIF, ainsi que la bille et l'anticorps anti-MDM2 et on regarde s'ils réagissent ensemble, sans MDM2, ce qui soit dit en passant serait embêtant). Au final cette immunoprécipitation nous permet de confirmer l'interaction entre MDM2 et VIF. 

 

C'est plus clair ? N'hésite pas sinon ! 

Edited January 20, 2022 by Pitchounou

[Juju_turtle]

C'est parfait, merci ! 

Même si je comprends mieux, j'ai toujours du mal à l'appliquer aux exos, par exemple pour celui là https://zupimages.net/viewer.php?id=22/03/g7zu.png est ce que tu peux m'expliquer comment tu raisonnes ?  (si tu as le temps et si ça te déranges pas bien sûr :)) 

Révélation

les réponses sont : ACDE 

 

[Pitchounou]

Il y a 2 heures, Juju_turtle a dit :

est ce que tu peux m'expliquer comment tu raisonnes ?

Allez c'est parti, on est là pour ça ! :)) 

 

Ici c'est à peu près le même principe. En fait la clé dans ce genre d'exercice c'est d'y aller pas à pas et de décortiquer. 

 

Analysons tout ça : 

 

• Déjà on peut facilement répondre à l'item A qui est vrai : l'anti S-100 dans le lysat cellulaire permet de vérifier qu'on a bien la présence de S100 dans les échantillons, puisqu'on a 2 bandes, 1 dans chaque colonne (Ca2+ et Ca2-). A quoi ça sert tu me diras ? Et bien si le but c'est de regarder si une protéine X par exemple interagit avec S100, si tu fais ta manip sans faire ce contrôle, tu pourrais en voyant dans un échantillon l'absence de protéine X être tenté de dire que ces 2 protéines n'interagissent pas. Or qu'est ce qui te dit que ce n'est pas simplement qu'il n'y a pas de protéine S100 ? S'il n'y a pas de S100 comme l'immunoprécipitation se fait avec un anti-S100 on ne risque pas de trouver de protéine X ! Tu vois ce que je veux dire ? 

 

• Le deuxième item il n'y a pas vraiment besoin de réfléchir au final, il est très faux, l'actine est un témoin de charge. J'ai fait une réponse sur un post par rapport à ça justement si ça t'intéresse : 
• Maintenant qu'on a vérifié que la manip était bien faite (on a bien les même bandes d'actines donc on a bien chargé la même quantité de protéines et correctement, et il y a bien S100 dans les 2 échantillons), on peut regarder la colonne d'immunoprécipitation et interpréter justement les résultats. Première information très très importante à repérer, avec quel anticorps fait-on l'immunoprécipitation ? Ici c'est un anti-S100. Que remarque t-on : en présence de calcium on a une bande pour l'étiquette His (donc la protéine Cacy) et une bande S100 avec immunoprécipitation avec anti-S100 : ces deux protéines interagissent. L'item C est donc vrai. 

 

• L'item D est faux (je crois que tu l'as mis vrai, tu es bien sur ? ). Cette interaction est bien dépendante du calcium puisque lorsqu'il n'y en a pas, colonne Ca2+ - on n'observe plus de bande correspondant à l'étiquette His, donc plus d'interaction. 

 

• Pour finir l'item E est tout à fait vrai, simplement ici on a fait le choix de prendre un anticorps anti-étiquette His, ce qui revient complètement au même puisque l'étiquette est attachée à la protéine. 

Dans ce genre d'exercice il s'agit juste de rester calme et de ne pas se perdre. Les items te font souvent découvrir l'exercice pas à pas. Tu vois au début ils te parlent des différents témoins, pour t'amener à réfléchir et comprendre que la manip a été faite correctement, puis ils t'interrogent sur les résultats en eux-même, qui sont toujours assez similaires. En effet si en faisant une immunoprécipitation avec un anticorps anti- X non seulement tu obtiens une bande correspondant à X mais également une bande correspondant à Y c'est que X et Y interagissent.

Il peut y avoir ensuite des variantes comme avec le calcium ici, il ne faut pas être effrayé ça ne change pas grand chose au final, simplement savoir si cette interaction est rompue ou pas. 

 

Est-ce que ça va mieux ? Désolé pour le pavé  N'hésite pas si c'est pas clair ! 

Edited January 21, 2022 by Pitchounou

[Juju_turtle]

Tout est super clair merciiii ! 

Concernant la D, en fait la prof nous avait montré vite fait cette exo en cours et nous avait dit d'y réfléchir chez nous, et elle nous avait donné les réponses, elle nous a bien dit que la D était juste, mais  elle s'est sûrement trompée ...

Il y a 7 heures, Pitchounou a dit :

Désolé pour le pavé 

J'appellerais pas ça un pavé mais une trooop bonne explication ! (il me fallait au moins ça pour comprendre )

Merci pour tes réponses  !

[Pitchounou]

Avec plaisir @Juju_turtle ! Bonne continuation :))