Ouistiti Posted October 30, 2015 Posted October 30, 2015 Bonsoir ! J'ai "quelques" difficultés face aux QCM 142 et 143 du tutorat. Ils sont liés donc je pense qu'il me suffit de comprendre le 142 pour réussir le 143. Mais je crois surtout que quelque chose m'a échappé dans la compréhension de la PCR ... Je n vois pas du tout comment fonctionnent les amorces Si quelqu'un pouvais m'éclairer ce serait très gentil ! Bonne soirée !
inesv Posted October 30, 2015 Posted October 30, 2015 Bonsoir, Pour les amorces en PCR, elles te permettent tout simplement de délimiter le fragment que tu souhaites amplifier. Pour le QCM 142, on te présente un gène avec exon 1 = 200 kpb intron 1 = 100 kpb exon 2 = 270 kpb intron 2 = 110 kpb exon 3 = 120 kpb intron 3 = 90 kpb exon 4 = 130 kpb Item C: On utilise les couples d’amorces a et c, a et g puis a et e. Il s’agit d’une rétro PCR sur ARNm, donc tu auras déjà eu élimination des introns et épissage alternatif. Ici, tu es dans le foie et l’énoncé te dit que ce gène aura subi un épissage alternatif de l’exon 2. Avec les amorces A et C Vu leur positionnement, tu amplifies tout ce qui est possible entre l’exon 1 et 4, c’est à dire l’exon 1 l’exon 3 l’exon 4 Ce qui te fait 200kpb + 120kpb + 130kpb = 450 kpb, c’est ce qu’on te propose dans les résultats d’électrophorèse. On utilise ensuite le couple A et G: Tu te rends compte que l’amorce G se trouve sur l’exon 2, or tu te trouves dans le foie, et l’énoncé te dit qu’il y a eu épissage alternatif de l’exon 2 → tu n’as ni l’exon 2, ni l’amorce, donc ici tu ne peux rien amplifier. Ça correspond bien au résultat d’électrophorèse qui ne te montre aucune bande pour cette proposition. Enfin, le couple A et E: Comme pour le couple A et C, tu amplifies tout ce qui est possible entre ces deux amorces/ entre les exons 1 et 3, c’est à dire exon 1 exon 3 Ça te fait donc 200 + 120 = 320 kpb. Voilà pour l’item C, ici les trois propositions sont justes, donc item juste. Item D Pour l’item D, attention à l’énoncé: On réalise ici une PCR avec de l’ADN, et non une rétro PCR avec ARNm → tu n’as pas encore eu d’épissage, ni d’épissage alternatif !! Le couple d’amorce A et C devrait te donner un fragment de 1020kpb, et le couple B et C un fragment de 720 kpb. Voilà pour ce qui concernait la PCR dans ce QCM. Si tu n’arrives pas à résoudre le 143 n’hésite pas à me le dire ! (et si tu as besoin d’être éclairé sur les autres items également) Bon courage
Ouistiti Posted October 31, 2015 Author Posted October 31, 2015 Merci beaucoup pour ta réponse ! Jai compris le 142 Par contre pour le 143 c'est pas trop ça ... J'ai regardé la correction mais je ne comprends pas tout ! Je comprends le raisonnement, pas de soucis là dessus par contre, il est dit qu'on reprend l'énoncé de l'item C du 142 c'est à dire le cas de la rétro PCR (enfin si j'ai bien tout compris jusque-là). Du coup, toujours d'après ce que j'ai compris, l'épissage est déjà réalisé donc il n'y a plus d'introns. Alors pourquoi dans la correction on nous dit qu'il y a des introns ? (Le 1 notamment) Est-ce parce que dans ce cas il faut envisager toutes le possibilités pour comprendre l'anomalie ? Je sais pas si je suis très claire dans mes questions mais comme je n'ai pas tout compris c'est pas évident d'expliquer :/ Merci beaucoup bonne journée !
inesv Posted October 31, 2015 Posted October 31, 2015 Re-salut ! Il faut bien que tu fasses la distinction entre la PCR et la RT-PCR au cours de la PCR, tu amplifies de l’ADN génomique, qui comporte alors les introns et les exons, il n’a subi encore aucune modification post-transcriptionnelle. au cours de la RT-PCR, tu amplifies de l’ADNc que tu as obtenu par rétro-transcription à partir d’ARNm: dans ce cas, il y a déjà eu épissage et éventuellement épissage alternatif. Cependant, dans ce QCM on te parle d’une éventuelle mutation; il se peut qu’elle touche les sites d’épissage, générant alors un défaut d’épissage (introns ou exons). Dans ce cas là, même en effectuant une RT-PCR, tu peux effectivement retrouver des introns dans ton résultat d’électrophorèse !! On te dit aussi que tu pars d’ARNm, donc il s’agit en fait de RT-PCR qui sont effectuées ici. A. En rajoutant une PCR supplémentaire pour le foie en utilisant les amorces f et g, nous trouverons sur l’électrophorèse un fragment de 370kpb. En effet, si tu regardes ton gène, tu vois l’amorce f positionnée sur l’intron 1, et l’amorce g à la fin de l’exon 2 → intron1 = 100 kpb et exon 2 = 270kpb, donc effectivement l’amplification entre ces deux amorces te donnera un fragment de 370kpb. B. Dans le foie, et dans le muscle, l’exon 3 est épissé avec les introns 2 et 3. Dans le foie, tu vois que lorsque tu utilises l’amorce E, qui se situe sur l’exon 3, tu n’obtiens pas de fragment: cela correspond certainement à l’absence de l’exon 3. de plus, quand tu fais une amplification entre les amorces B et C (piste 2), tu obtiens un fragment de 400 kpb. Si ton ARNm et donc ton ADNc avait été «normal", tu aurais du obtenir une amplification entre ces deux amorces correspondant à l’exon 2 + exon 3 + exon 4, soit 270 + 120 + 130 = 520 kpb. Tu as donc un excédent de 120 kbp, qui correspond bien à l’épissage de l’exon 3, en même temps que l’intron 2 et 3 (pour lesquels l’épissage est normal) C. Il semblerait que la mutation soit présente au niveau des sites d’épissage. Elle induirait la conservation de l’intron 1 et de l’exon 2 dans le foie. Ce qui entraine une modification du cadre de lecture, rendant la protéine totalement différente et non fonctionnelle. Toujours par rapport à l’énoncé de l’exercice précédent, on te dit que l’exon 2 subit un épissage alternatif dans le foie. Ici, quand tu réalises une amplification de l’ADNc du foie entre les amorces B et C, tu obtiens un résultat en électrophorèse. Pourtant, l’amorce B est localisée sur l’exon 2 → il n’a pas été épissé. De plus, si tu fais une amplification entre les amorces A et C, tu obtiens un fragment de 700kpb. Tu devrais obtenir, si tu avais l’épissage attendu, c’est à dire de tous les introns + exon 2: 1020 kpb - ( exon 3 + intron 1 + intron 2 + intron 3) = 600 kpb. → on a une différence de 100kpb en excédent entre le fragment attendu et celui obtenu, qui correspond à la taille de l’exon 2. La présence anormale de cet exon 2 modifie le nombre de paires de bases entre l’ATG de l’exon 1 et le codon stop, ce qui est effectivement susceptible de modifier le cadre de lecture. D. Il semblerait que l’exon 2 et l’exon 4 soient dans le même cadre de lecture, ce qui expliquerait que la seule perte de l’exon 3 soit peu délétère pour le muscle. Le gène étudié a deux ATG, sur l’exon 1 et 2. Dans le muscle a lieu un épissage alternatif de l’exon 1, donc l’ATG utilisé est celui de l’exon 2. L’énoncé nous précise que dans le muscle, on obtient une protéine plus courte, mais fonctionnelle → cela signifie que, malgré l’épissage de l’exon 3, le cadre de lecture n’a pas été décalé et la traduction peut toujours avoir lieu. E. Il semblerait que l’exon 3 ne code pas pour la partie active de la protéine dans le muscle. En effet, car malgré son épissage, la protéine produite dans le muscle est toujours fonctionnelle ! Voilà voilà, est-ce-que c’est plus clair pour toi ?
Ouistiti Posted October 31, 2015 Author Posted October 31, 2015 Merci beaucoup déjà c'est plus clair Par contre je suis vraiment désolée mais j'ai un problème avec le C :/ Ne ne vois pas pourquoi tu enlèves l'exon 3 dans ton calcul ? Et la différence de 100 paires de bases de correspond pas à l'intron 1 ? Je suis vraiment désolée mais je vois pas trop
Solution inesv Posted October 31, 2015 Solution Posted October 31, 2015 Je me suis embrouillée dans mon explication c'est de ma faute, désolée ! La première partie de l'explication reste la même, quand tu réalises une amplification de l’ADNc du foie entre les amorces B et C, tu obtiens un résultat en électrophorèse. Pourtant, l’amorce B est localisée sur l’exon 2 → il n’a pas été épissé. Ensuite, quand tu considères l'amplification faite entre les amorces A et C, - tu sais que l'exon 3 est épissé (cf item B ) - tous les introns doivent être épissés Si on considère que l'exon 2 est épissé (cf énoncé), tu devrais obtenir un fragment qui correspond à exon 1 + exon 4 = 330 kpb. Or, d'après ton résultat d'électrophorèse, tu vois que le fragment obtenu mesure 700kpb. Comme ce qu'on a supposé juste au dessus, on va considérer que l'exon 2 n'a finalement pas été épissé; alors ton fragment obtenu est de exon 1 + exon 2 + exon 4 = 600 kpb. Tu as encore 100kpb qui ont été amplifiées et dont tu ne connais pas l'origine - comme on l'a montré dans l'item B, l'exon 3 a été épissé, donc il s'agit forcément d'un intron qui est présent dans le fragment amplifié - le seul intron qui a la bonne taille = 100 kpb est l'intron 1, donc c'est bien lui qui n'a pas été épissé. Donc au final, on a bien montré que l'intron 1 et l'exon 2 n'ont pas été épissés dans le foie. Est ce que c'est plus clair ?
Ouistiti Posted October 31, 2015 Author Posted October 31, 2015 Oui !!! J'ai compris ! merci beaucoup pour tes explications et ta patience
inesv Posted October 31, 2015 Posted October 31, 2015 c'est parfait, avec plaisir ! bon courage et bon week end
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