QCM 6 page 16 poly TD

[Ouistiti]

Bonsoir !

 

Je rencontre des difficultés face au qcm page 16 numéro 6. Je pense que je n'ai pas du tout compris le principe

 

Je le joinds ce sera plus simple ! (Désolée pour la qualité)

 

Merci pour votre aide

[inesv]

Bonsoir ! 

 

Dans l’énoncé, on vous dit que le plasmide recombinant doit permettre l’expression, dans les bactéries transformées, de toute la séquence de la protéine recombinante. 

On vous dit aussi que le plasmide n’a pas d’ATG (il n’a pas de stop non plus). 

Pour que ta protéine soit produite, tu dois alors garder l’ATG et le stop de l’ADNc.

 

Dans les items B, C et D, on te propose de digérer l’ADNc avec SpeI et/ou SacI. 

Si tu regardes ton fragment, tu vois que leurs sites de restrictions respectifs se trouvent entre l’ATG et le STOP → en utilisant ces enzymes, tu enlèves l’ATG et/ou le stop, du coup la protéine ne pourra pas être exprimée. Ces trois items sont donc faux. 

 

Par contre dans l’item E, la digestion du plasmide par XbaI se fait avant l’ATG donc c’est compatible avec l’expression de la protéine. 

 

Pour l’item A, on te propose de digérer le plasmide et l'ADNc avec EcoRI → en procédant comme ça, tu ne peux pas être sur que l’ADNc va s’insérer dans le bon sens (c’est à dire avec l’ATG avant le stop, par rapport au promoteur), vu que les extrémités produites seront compatibles. Si il s’insère dans le mauvais sens, tu ne produiras alors pas de protéine recombinante. 

 

Voilà, j'espère avoir été claire. Si c'est pas le cas, n'hésite pas à me le dire ! 

Bonne soirée et bon courage  

[Ouistiti]

Bonsoir !

 

Merci pour ta réponse

 

Par contre, je n'ai pas tout compris. Je vais essayer d'expliquer au mieux ce que je ne comprends pas !

 

Pour la B et la C et la D, pas de soucis j'ai compris !

 

Mais la E me pose encore question ... Le plasmide comporte des extrémités cohésives pour EcoR I. Mais si on coupe avec Spé I, ce n'est pas compatible avec le plasmide si ?

[elisa1195]

Salut ! 
Alors pour l'item E je vais essayer de te l'expliquer plus en détail   

 

Alors tout d'abord on digère le plasmide avec Spe1 et EcoR1 donc tu te retrouves avec ton plasmide qui est ouvert au niveau du SCM avec une extrémité Spe1 du côté du promoteur et une extrémité EcoR1 du côté ORI.

 

Ensuite on digère l'ADNc par Xba1 donc on se retrouve ici avec un ADNc qui a une extrémité Xba1 du côté de l'ATG et une extrémité EcoR1 après le codon stop (car on t'a dit dans l'énoncé que l'ADNc possède des extrémités cohésives EcoR1).

 

Maintenant que tu sais les extrémités que tu as obtenu, il faut que tu regardes si elles sont compatibles ! 
Ici il fallait que tu te serves des spécificités des endonucléases données au QCM 5 et ça te permets de voir que :

- EcoR1 n'est pas compatibles avec Spe1 ni Xba1

- Spe1 et Xba1 sont compatibles ! 

 

Ainsi au final quand tu ajoutera ton ADNc au plasmide, l'extrémité Xba1 de l'ADNc ira se liée à l'extrémité Spe1 du plasmide (ce qui est bien car ainsi l'ATG se place juste après le promoteur) et les 2 extrémités EcoR1 vont se lier entre elles et donc tu aura ton codon stop intégré également au plasmide afin de finir la transcription et permettre l'expression de ta protéine, donc l'item E est vrai ici 

 

J'espère avoir été assez claire sinon n'hésites pas à le dire ! Bon courage ! 

[Ouistiti]

Ça y est j'ai compris !

 

Mais j'ai encore une question ... Dans le À cette fois (même si ce n'est pas vraiment la question ici). Si on digère juste le plasmide par EcoR I, le plasmide ne peut-il pas se refermer sur lui même sans avoir l'ADNc ?

[elisa1195]

Si tu as raison, que ce soit pour le plasmide ou pour l'ADNc, si tu digères par une même enzyme ou par 2 enzymes compatibles alors il te faut une étape de déphosphorylation afin d'éviter que les extrémités ne se rejoignent ! 

[Ouistiti]

Cette fois je crois que c'est bon !

Merci beaucoup et bonne soirée !!!

[elisa1195]

Avec plaisir ! Bonne soirée et bon courage !