PCR temps réelle

[diana]

Salut !

En revoyant mon cours j'ai du mal à comprendre les diapos de LAGIN sur la PCR en temps réel, surtout les courbes...

(je mets les diapos pour que vous voyez  de quoi je parle)

Est-ce que quelqu'un pourrait m'expliquer svp

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[pomelo]

Helloooo, 

 

Attention pavé en vu , je ne sais pas si le Pr Langin vous détaille autant les diapos, mais voilà ce que je peux te dire :

 

La PCR en temps réel est quantitative. Elle permet de mesurer la quantité d'ADN produite par cycle. Avec la PCR quantitative, utiliser des échelles logarithmiques permet de représenter de façon condensé des écarts très importants.

 

1ère diapo : Normalement, il y a proportionnalité entre la quantité d'ADN de départ et la quantité d'ADN final selon la règle des 2^n. Chaque groupe de trait correspond à un tube qui avait exactement la même quantité d'ADN au départ. On voit donc qu'il n'y a pas de proportionnalité au point final entre la quantité d'ADN de départ et la quantité d'ADN finale. 

 

2ème diapo : Il existe des intercalants de l'ADN (type le fluorochrome SYBR green), qui se fixent dans le petit sillon de l'ADN (indépendamment de la séquence) et qui permettent de déduire la quantité d'ADN produite durant la PCR (je t'explique tout ça après ). Pour fixer l'agent intercalant, il faut dénaturer l'ADN (à ce moment, l'agent n'est pas fixé donc ne fluoresce pas).

Lorsqu'on repolymérise l'ADN, l'agent s'est fixé et donc fluoresce, représentant ainsi la quantité d'ADN produite par cycle. Pour dénaturer l'ADN, il faut le chauffer à environ 95°C, puis pour permettre la polymérisation (et la fluorescence), on le refroidit à 72°C pendant 2 min puis à 60°C pendant 30 secondes, puis on recommence un cycle.

Une caméra CCD est caapble de détecter la fluorescence émise dans chaque tube. A chaque fin d'élongation, il y a détection de la fluorescence, proportionellement à la quantité d'ADN double brin.

La PCR est extrêmement sensible et permet de détecter de très faibles quantités d'ADN.

 

3ème diapo : on combine la réaction de reverse transcription avec le principe de la PCR quantitative. On prend des ARNm que l'on reverse transcrit en ADNc, puis on effectue une PCR avec.

Chaque courbe correspond à un foie de rat différent. 

Chez les rats nourris, on voit qu'il y a une augmentation beaucoup plus précoce de la phase exponentielle : l'ARNm de l'AG synthétase est présent en plus grande quantité que chez les rats à jeun au départ (et à l'arrivée aussi si on regarde le plateau).

 

J'espère que c'est plus clair pour toi, peut-être que tout ce que je t'ai dit n'est pas dit en cours, donc ne te force pas à retenir tout ça, le but c'est que tu ai compris le principe et l'intérêt de la PCR en temps réel (et de la RT-PCR)

[diana]

Waw merci beaucoup d'avoir pris le temps de tout expliquer, j'ai tout compris franchement merci ! 

Mais juste une dernière précision, le fait que la courbe ne soit pas proportionnelle veut simplement dire que la quantité d'ADN avec la PCR n'évolue pas de manière "régulière" entre le début et la fin  ? Et la ligne rouge correspond à la limite de la proportionnalité ?

[pomelo]

C'est ça, ça veut dire qu'il n'existe pas de relation linéaire (type f(x)=ax+b) pour décrire la courbe.

 

La ligne rouge correspond au seuil de détection, c'est à dire le moment où il y a assez d'ADN pour être détecter par la PCR. Quand tu fais un exercice de PCR il faut pas utiliser ce qui se trouve sous cette ligne rouge.

[diana]

D'accord je comprends mieux

Merci beaucoup !!