cours techniques ADN et plasmides

[Inconnu_2023]

bonjouur , je vais etre direct j'ai beau faire 6377 exo dessus j'ai l'impression d'avoir un cerveau casse genre je comprend pas j'ai tjrs plein de choses fausses pr les qcm sur les plasmides et vu que ca tombe tt le tps faut que je comprenne donc je demande si c possible de m'expliquer de A a Z tt ce premier le qcm 1 https://tutoweb.org/tat_librairie/Innovations Pédagogiques/Fiches astuces/S2/PASS/S2 - Fiche Astuce - PASS - Recherche (Vecteurs et Plasmides).pdf en details (parce que oui mm avc la fiche astuce je comprend pas )

 

1- clonage oriente ou non orienter : pr savoir est ce qu'on regarde si on utilise l'enzyme BAMH1 deux fois de suite sur le pPOM ou sur le LUMI + pPOM ? genre pr que ca soit non orienter il faut regarder ce que j'ai entourer en violet ou bien ce que j'ai entourer en rouge : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/20/f8zp.png ? 

 

2-si j'ai bien compris l'item B est faux parce que il aurait fallu PST1 dans les deux + ECo R1 dans les deux https://zupimages.net/viewer.php?id=21/20/7tdj.png ??? autrement dit pr que ca soit possible il faut tjrs avoir les enzymes autant presentes dans lumi que dans pPOM ?

 

3-https://zupimages.net/viewer.php?id=21/20/nfjn.png Quelles sont els chiffres qu'il faut regarder dans les vecteurs pr avoir ces chiffres ? je comprend rien a rien a ce raisonnement je sais pas si il faut regarder dans lumi ? je sais pas quoi regarder ? dan quelle sens regarder ? genre je suis larguer 

 

4- https://zupimages.net/viewer.php?id=21/20/kq5w.png est ce qqun peut m'expliquer parce que jcomrpend pas le raisonnement 

 

voila jsui desole mais je comprend plus du tt et quand jreprend ca c si vague je fais n'importe quoi donc merci bien de votre reponse  

 

 

tant qu'on y est je rajoute une question supp comme ca c'est fait on me dit ici que on peut pas utiliser non c'est moi parce que son promoteur est pas eucaryote mais y'as des promoteurs procaryote dans les deux jsui vraiment perdu https://zupimages.net/viewer.php?id=21/20/9xjm.png 

[OxyGenS]

Salut @Inconnu_de_2021,

 

A. Reprenons du début :

• Qu'est-ce qu'un clonage non orienté ? C'est quand tu vas utiliser 1 seule et même enzyme de restriction pour digérer les plasmides (ou parfois tu peux utiliser 2 enzymes différentes mais donnant des extrémités compatibles : c'est ce qu'on appelle des isocaudomères. Je n'ai pas souvenir d'avoir déjà vu ça en annales donc ne t'y attarde pas). Qu'est-ce que ça implique ? Ton insert va pouvoir se mettre dans les 2 sens.
• Qu'est-ce qu'un clonage orienté ? C'est quand tu vas utiliser 2 enzymes de restriction différentes (et qui ne sont pas isocaudomères). Qu'est-ce que ça implique ? Le sens d'insertion de ton fragment (= insert) sera maîtrisé. Exemple (pas de rapport avec le qcm) : l'extrémité de l'insert clivée par Pst1 se collera avec l'extrémité du plasmide clivée par Pst1 et idem avec la 2è enzyme (ex : HindIII).

Dans ce QCM on est dans le 1er cas de figure : on clive tout par une seule et même enzyme : BamH1 => c'est donc non orienté.

 

B. Ici que cherche-t-on à faire ? On veut insérer le promoteur venant du plasmide pPROM dans le plasmide Lumi.

Que demande l'item ? Il demande si on aurait pu faire la même manip avec EcoR1 et Pst1.

• Je regarde sur le plasmide pPROM si avec ces enzymes on peut extraire le promoteur dans son intégralité. => OUI, on voit bien que c'est possible.
• Je regarde sur le plasmide Lumi (qui doit accueillir le promoteur) si on peut le cliver par ces enzymes (et sans que ça n'affecte les autres parties de ce plasmide). => NON, on voit qu'il n'y a pas de site de restriction pour EcoR1. Donc tu avais bien raisonné mais pense à vérifier que ça ne touche pas aux autres éléments de Lumi

C. 2 choses à vérifier pour ce genre d'item :

a) cb de sites de restriction pour Pst1 a-t-on sur le plasmide recombinant (c'est-à-dire ayant intégré le promoteur) ?

b) s'il y a un seul site de restriction, quelle est la taille du plasmide recombinant ?

 

Réponses :

a) Sur le plasmide Lumi, on a un site pour Pst1.

Mais attention, il faut aussi regarder sur l'insert : on voit que sur l'insert (= partie de pPROM se situant entre les 2 sites BamH1) on a aussi un site pour Pst1)

=> sur le plasmide recombinant on aura 2 sites de restriction pour Pst1. Donc déjà tu pouvais mettre l'item faux.

b) S'il n'y avait eu qu'un seul site pour Pst1, alors tu calcules la taille de l'insert : 1600 - 800 = 800 et tu additionnes avec la taille de Lumi : 800 + 5200 = 6000 pb

Le piège ici c'est qu'il y avait 2 sites pour Pst1 donc ça donne 2 fragments.

 

 

D. On refait un peu le même raisonnement : on regarde le nb de sites de restriction pour HindIII sur le plasmide recombinant.

Sur Lumi : 2

Sur l'insert : 2

=> 4 fragments, c'est aussi ce que propose l'item donc on continue notre raisonnement.

 

Pour continuer je te conseille vivement de te faire un schéma où tu mets TOUS les sites de restriction du plasmide recombinant et leur position (ex : 1000 pr Xho1).

 

/!\ Il faut se rappeler que le clonage est non orienté donc il y a 2 possibilités d'insertion pour le promoteur/insert : soit dans le bon sens, soit dans le sens inverse.

Il faut donc calculer les positions pour les 2 cas.

 

Si c'est dans le bon sens :

- ORI

- Promoteur procaryote

- ADNc codant la résistance à la kanamycine

- terminateur

- 1000 : Xho1

- 1200 : HindIII

- 1300 : BamH1 (et là on va avoir notre insert donc on ajoute les sites de restriction présents sur l'insert venant de pPROM). C'est là qu'on a besoin de qques calculs.

- 1310 : HindIII

- 1320 : EcoR1

- 1330 : Xho1

- 1620 : HindIII

- 2000 : Pst1

- 2100 : BamH1 (fin de l'insert/promoteur)

- 2150 : Pst1

- ADNc de LUMI

- terminateur

- 3400 : HindIII

- promoteur constitutif eucaryote

- ADNc codant la résistance à la puromycine

- terminateur

 

Quels fragments obtient-on si digestion par HindIII ?

x 3400 - 1620 = 1780pb

x 1620 - 1310 = 310 pb

x 1310 - 1200 = 110 pb

x appelons le dernier fragment y.

On sait que 6000 = y + 1780 + 310 + 110 <=> y = 6000 - 2200 = 3800

 

OK j'ai un pb, je crois qu'ils se sont trompés dans leur correction. Pour moi le dernier site de restriction HindIII ne reste pas à 2600pb, ils ont oublié d'ajouter la taille de l'insert (soit 800pb).

Je laisse quand même mes calculs et mon raisonnement pour que tu comprennes mais ne t'attarde peut-être pas trop sur cet item.

 

Du coup c'était censé être correct quand l'insert est dans le bon sens, je ne fais pas les positions quand c'est dans le mauvais sens mais si tu le veux je pourrais les faire.

 

E. On transforme des bactéries. Bactéries = procaryote.

Sur le plasmide recombinant tu as 2 résistances à des antibio : kanamycine et puromycine.

SAUF que les 2 ADNc ne sont pas tous les 2 sous la dépendance d'un promoteur procaryote, c'est le cas uniquement du cDNA codant la résistance à la kanamycine.

Qu'est-ce que ça signifie ? Ça veut dire que dans les bactéries, seul le cDNA codant la résistance à la kanamycine sera exprimé => les bactéries ayant intégré ce plasmide seront résistantes uniquement à la kanamycine.

 

Le piège ici c'était de regarder le plasmide pPROM car on voyait que la résistance à l'ampicilline est sous la dépendance d'un promoteur procaryote. Sauf que le plasmide recombinant n'est pas pPROM mais Lumi + insert.

 

 

 

Question supp : Ici on veut faire exprimer le cDNA en bas de la diapo dans des cellules musculaires humaines. Qui dit humain dit eucaryote => on a besoin que le cDNA soit sous la dépendance d'un promoteur eucaryote.

Maintenant, regardons par quelles enzymes on peut cliver le cDNA pour l'insérer en entier, sachant qu'il faut ces mêmes enzymes sur le plasmide qui accueille.

=> le cDNA doit être clivé par BamH1 et Pst1

--> si on regarde le plasmide Noncestmoi, il y a bien des sites de restriction pour BamH1 et Pst1. Déjà ça c'est bon.

Sauf que le promoteur en amont est procaryote donc ce n'est pas bon pour notre objectif qui est d'exprimer le cDNA dans des cellules humaines

--> si on regarde le plasmide Cestmoi, il y a bien des sites de restriction pour BamH1 et Pst1. Déjà ça c'est bon.

Et bingo le promoteur en amont est eucaryote : on va pouvoir utiliser ce plasmide pour atteindre notre objectif !

 

 

 

Voilà j'espère que c'est plus clair et que je n'ai pas fait d'erreurs

Edited May 20, 2021 by OxyGenS