Ancien Responsable Matière fée_cloclochette Posted April 21, 2021 Ancien Responsable Matière Posted April 21, 2021 Hellooo, a moins de 2 semaines du concours il serait temps de se rendre compte que les plasmides sont des mystères Après avoir fait le concours blanc je ne comprend absolument rien Le concours blanc proposait 2 plasmides (alors déjà ça commence dans les questions je ne sais donc jamais quel plasmides il faut que je regarde pour répondre...) https://zupimages.net/viewer.php?id=21/16/rk72.png Pour commencer le qcm 1 : la C comptée vrai... MAIS COMMENT TROUVER SES FICHUS TAILLES (soustraire quoi avec quoi quel plasmide en premier ou quand comment? est ce que ce sera toujours pareil ?) et pour l'item E je ne sais pas quel plasmide regarder... (enfait quand on a deux plasmides je dois loucher sur les deux et faire un plouf plouf pour choisir lequel choisir : clairement très mauvaise idée de faire la le jour du concours) https://zupimages.net/viewer.php?id=21/16/mqtd.png pour le qcm 2 : bonne réponse CDE c'est l'item C qui me pose soucis... : on se retrouve avant transfection donc selon moi dans le plasmide pProm (ou j'ai encore mal choisi?) donc pour pouvoir sélectionner un plasmide contenant le promoteur il faut une enzyme qui coupe à l'interieur du promoteur? Et enfin merveilleux qcm 3 qui m'a fait faire un plongeons direct dans le négatif : bonne réponse AB pour l'item A : toujours et encore la même question quel plasmide regarder et quels enzymes tester (parce qu'il y en a pleins pleins pleins) ? et comment les tester pour savoir s'ils elles donneront un clonage non orienté ? - item B et C comment évaluer le sens d'insertion du promoteur ? Pst1 est situé juste après le promoteur et Not1 juste avant... je ne comprend pas comment l'un peu évaluer le sens est pas l'autre vu qu'il l'entoure - item D encore un problème de calcul je ne sais pas comment calculer les fragments obtenus ? soustraire quoi avec quoi... dans la correction ils disent que ce sont les fragments que l'on aurai obtenu si le promoteur était intégré dans le mauvais sens (woow j'apprend encore un truc que les tailles peuvent etre différente en fonction du sens...) me voilà arrivée à la fin de mon histoire si quelqu'un peu essayer de sauver mes pauvres petites ailes pour me permettre de m'envoler vers quelques points positifs sur les plasmides la fée clochette vous en sera éternellement reconnaissante ! bisouuxxx Quote
Solution Juliette82 Posted April 21, 2021 Solution Posted April 21, 2021 Salut ! je vais essayer de répondre à toutes tes questions ! QCM1 : Pour les plasmides, il y en a deux parce qu'on prend une partie d'un pour l'insérer dans l'autre. Il faut que sur ton brouillon à côté tu dessines ton nouveau plasmide ça sera plus facile pour toi. Premièrement, tu coupes ton premier plasmide avec EcoR1 et HindIII. Quand tu regardes sur le plasmide ces sites de restrictions sont à respectivement 2300pb et 1500pb donc le fragment que tu coupe fait au final 2300pb - 1500pb = 800pb. Ce fragment que tu as digéré tu vas par la suite l'intégrer dans le deuxième plasmide parce que tu veux le promoteur pour exprimer au final le gène d'intérêt. Pour cela faut couper le plasmide et intégrer le fragment. On te dit que tu coupes le deuxième plasmide avec les mêmes enzymes EcoR1 et HindIII. Quand tu coupes ce plasmide avec ces deux enzymes tu perds un bout du plasmide (le fragment entre les deux sites de restrictions) qui fait ici : 3100 - 2900 = 200pb. Donc ton plasmide 2 qui faisait de base 3700pb ne fait plus que 3500pb. MAIS tu lui rajoutes ton fragment du premier plasmide qui fait 800pb donc ton plasmide 2 au final fait 3500 + 800 = 4300pb. Donc ça c'est le travail que tu fais en amont avant de commencer à lire les items. Ce que tu peux remarquer c'est que le fragment du plasmide 1 que tu as intégré dans le plasmide 2 contient des sites de restrictions dont un site Not1. Donc pour l'item C, quand tu coupes avec Not1 tu vas couper à deux endroits. Quand tu fais sur ton brouillon ton dessin de ton plasmide recombiné avec tous les sites de restrictions et leur emplacement tu vois que quand tu coupes tu obtiens bien deux fragments, un de 2400pb et un de 1900pb. Pour l'item E : ton plasmide recombinant c'est le deuxième où tu as intégré un fragment du premier. Cependant, le fragment du 1er que tu intègres ne porte pas de gène de résistance à l'ampicilline et ton deuxième plasmide n'en as pas donc c'est faux. Pour les QCM comme cela, le mieux est vraiment de dessiner ton plasmide recombinant, avec les sites de restrictions, les gènes qu'il a etc... QCM 2 : Pour l'item C, avant transfection veut dire avant qu'on mette le plasmide recombinant dans les cellules eucaryotes, donc on est pas dans un des deux plasmides, on est dans le plasmide recombinant, qui est la somme des deux en quelque sorte. On a vu item C du QCM1 que quand tu as le plasmide recombinant donc avec le promotteur, quand tu coupes avec Not1 tu obtiens deux fragments. Alors que quand tu as pas le plasmide recombinant, que tu as le plasmide 1 ou 2 et que tu coupes avec la même enzyme tu obtiens que un seul fragment. Donc tu pourras sélectionner les plasmides avec le promoteur (plasmide recombinant qu'on veut) en utilisant cette enzyme. QCM3 : item A : alors premièrement tu veux toujours couper un fragment dans le premier plasmide qui contient le promoteur pour l'insérer dans le plasmide 2 et exprimer la protéine d'intérêt. Donc première étape, tu regardes avec quelles enzymes tu pourrais couper le plasmide 1 pour avoir un fragment avec le promoteur intact. Déjà tu oublies Not1 et Pst1 car elles coupent dans le promoteur ce qu'on veut pas sinon il sera pas actif. Il te reste comme choix, Nco1 et Xho1. Tu vois qu'avec les deux tu peux couper de part et d'autres du promoteur et tu auras toujours un fragment qui contient le promoteur intact. Le plasmide 1 ayant deux sites de restrictions pour chaque enzymes de part et d'autres du promoteur, quand tu coupes qu'avec Nco1 ou qu'avec Xho1 cela va générer un fragment qui aura les mêmes embouts de chaque côté et qui pourra du coup s'intégrer sans être orienté, d'où dans litem "non orienté". Quand tu coupes ton plasmide 2 ensuite pour insérer le fragment, il faut vérifier si le plasmide a des sites de restrictions pour ces enzymes et si quand tu coupes et que tu insers, ton fragment sera avant le gène pour que le promoteur agisse en amont du gène et donc avoir son expression. Et tu te rends compte que sur le plasmide 2 si tu coupes avec Nco1 ou Xho1 tu pourras avoir l'insertion de ton promoteur avant le gène. Donc l'item est vrai. @Hypnos j'avoue que item B et C je sèche un peu, si tu pouvais m'aider stp. Quote
Charette Posted April 22, 2021 Posted April 22, 2021 Salut ! Pour tes items B et C du QCM 3, il faut que tu te sois projetée dans le plasmide recombiné. Il mesure 3700 + 600 pb (nombre de base de l'insert) = 4300 pb. Ensuite on remet en place les différents sites de coupure qui nous intéressent : on a un Not 1 à 800 pb, un Pst1 à 1150 pb, et ensuite, SI L'INSERT EST DANS LE BON SENS, on a une autre Not1 à 3000 + 200 pb = 3200 pb, et un autre Pst1 à 3000 + 300 pb = 3300 pb. Si on utilise l'enzyme Not1 pour couper le plasmide recombiné : on va se retrouver avec 2 fragments : - Un de 3200 - 800 pb = 2400 pb - Un de 4300 - 2400 pb = 1900 pb --> Dans ce cas on a 2 fragment de taille différentes Si on utilise l'enzyme Pst1 pour couper le plasmide recombiné: on va se retrouver avec 2 fragments : - Un de 3300 - 1150 pb = 2150 pb - Un de 4300 - 2150 pb = 2150 pb --> Dans ce cas la, on se retrouve avec des fragments de meme taille Il faut alors comparé avec ce que l'on obtient si l'insert est dans le MAUVAIS SENS. On recalcule les sites de coupure : Not 1 à 800 pb et 3000 + 400 pb = 3400 pb ; Pst1 à 1150 pb et à 3000 + 300 pb = 3300 pb Quand on utilisera Not1, on se retrouvera avec : - Un fragment de taille 3400 - 800 pb = 2600 pb - Un fragment de taille 4300 - 2600 pb = 1700 pb --> La taille des fragments est différentes en fonction de si l'insert est dans le bon ou le mauvais sens --> Not1 permettra de déterminer si le promoteur est dans le bon sens. Quand on utilisera Pst1, on se retrouvera avec : - Un fragment de 3300 -1150 pb = 2150 pb - Un fragment de 4300 - 2150 pb = 2150 pb --> La taille des fragments est la même quel que soit le sens de l'insert --> Pst1 ne permettra pas de déterminer le sens du promoteur. Quote
Ancien Responsable Matière fée_cloclochette Posted April 23, 2021 Author Ancien Responsable Matière Posted April 23, 2021 wow vraiment merci beaucoup pour votre aide super détaillée ! j'ai tout compris ! @Charetteet @Juliette82 Charette and Juliette82 2 Quote
Lilou Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 Slt, je m'incruste, Le 21/04/2021 à 22:22, Juliette82 a dit : Premièrement, tu coupes ton premier plasmide avec EcoR1 et HindIII. Quand tu regardes sur le plasmide ces sites de restrictions sont à respectivement 2300pb et 1500pb donc le fragment que tu coupe fait au final 2300pb - 1500pb = 800pb. Ce fragment que tu as digéré tu vas par la suite l'intégrer dans le deuxième plasmide parce que tu veux le promoteur pour exprimer au final le gène d'intérêt. Pour cela faut couper le plasmide et intégrer le fragment. On te dit que tu coupes le deuxième plasmide avec les mêmes enzymes EcoR1 et HindIII. Quand tu coupes ce plasmide avec ces deux enzymes tu perds un bout du plasmide (le fragment entre les deux sites de restrictions) qui fait ici : 3100 - 2900 = 200pb. Donc ton plasmide 2 qui faisait de base 3700pb ne fait plus que 3500pb. MAIS tu lui rajoutes ton fragment du premier plasmide qui fait 800pb donc ton plasmide 2 au final fait 3500 + 800 = 4300pb. Donc ça c'est le travail que tu fais en amont avant de commencer à lire les items. Ce que tu peux remarquer c'est que le fragment du plasmide 1 que tu as intégré dans le plasmide 2 contient des sites de restrictions dont un site Not1. Toute cette partie c'es ok pour moi d'ailleurs ton expli est top Le 21/04/2021 à 22:22, Juliette82 a dit : Donc pour l'item C, quand tu coupes avec Not1 tu vas couper à deux endroits. Quand tu fais sur ton brouillon ton dessin de ton plasmide recombiné avec tous les sites de restrictions et leur emplacement tu vois que quand tu coupes tu obtiens bien deux fragments, un de 2400pb et un de 1900pb. Mais là je ne trouve tjrs pas les fragments .... @Juliette82 tu pourais me détailler le calcul stp Quote
Ancien Responsable Matière fée_cloclochette Posted April 23, 2021 Author Ancien Responsable Matière Posted April 23, 2021 il y a 3 minutes, Lilou a dit : Mais là je ne trouve tjrs pas les fragments .... @Juliette82 tu pourais me détailler le calcul stp salut @Lilou : dans le deuxieme message tu as l'explication pour trouver les fragments ! Il y a 20 heures, Charette a dit : Si on utilise l'enzyme Not1 pour couper le plasmide recombiné : on va se retrouver avec 2 fragments : - Un de 3200 - 800 pb = 2400 pb - Un de 4300 - 2400 pb = 1900 pb --> Dans ce cas on a 2 fragment de taille différentes Voilouuuu!! Quote
cassolnousmanque Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 j'ai vu un sujet plasmide je me suis dit "c'est pour moi !" donc j'ai sauté sur l'occasion mais en fait vous avez déjà trop bien répondu à la question pour que j'ai quelque chose à rajouter Charette 1 Quote
Lilou Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 Il y a 20 heures, Charette a dit : on a une autre Not1 à 3000 + 200 pb = 3200 pb, et un autre Pst1 à 3000 + 300 pb = 3300 pb. Cette partie j'ai pas bien compris comment on fait tu as compris toi ? @cassolnousmanque tu pourrais m'aider peut être Il y a 20 heures, Charette a dit : - Un de 3200 - 800 pb = 2400 pb - Un de 4300 - 2400 pb = 1900 pb Ça aussi j'ai du mal à comprendre les plasmides c'est l'horreur Quote
Juliette82 Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 (edited) il y a 10 minutes, Lilou a dit : Toute cette partie c'es ok pour moi d'ailleurs ton expli est top Merci beaucoup ! il y a 10 minutes, Lilou a dit : Mais là je ne trouve tjrs pas les fragments .... @Juliette82 tu pourais me détailler le calcul stp alors je t'ai fais un dessin avec le plasmide recombinant et en rouge les croix où tu coupes du coup et en dessous les calculs. Pour le premier calcul tu fait la différence entre les deux sites de restrictions soit 3200 - 800 = 2400pb et pour le deuxième tu fais la taille totale du plasmide auquel tu soustrait ton premier fragment et ca donne 1900pb Edited April 23, 2021 by Juliette82 Charette and Lilou 2 Quote
cassolnousmanque Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 il y a 2 minutes, Lilou a dit : Cette partie j'ai pas bien compris comment on fait tu as compris toi ? @cassolnousmanque tu pourrais m'aider peut être Ça aussi j'ai du mal à comprendre les plasmides c'est l'horreur alors j'avais déjà expliqué ce sujet en message privé donc je te mets ce que j'avais dit ici, peut être que tu trouveras ça plus clair Tu vois que tu as un Not1 à 800 pb (on l'appellera Not1(800) et tu vois aussi que dans le fragment que tu as inséré, il y a un site Not1 à 1800 par rapport à pProm , donc après insertion il se retrouve à 2900+300= 3200 pb par rapport à phospho (on l'appellera Not1(3200) comme tu as 2 sites pour Not1, tu vas obtenir 2 fragments suivants : le premier : de Ori à Not1(800) + de Not1(3200) à Ori le deuxième : entre Not1(800) et Not1(3200) donc ton premier fragment fera (800 -0) + (4300 - 3200) = 800 + 1100 = 1900 pb (sachant que le 4300 c'est la taille du plasmide après insertion du promoteur eucaryote tissu spécifique que je t'ai expliquée à la question B) et ton deuxième fragment fera 3200-800 = 2400 pb Lilou 1 Quote
Juliette82 Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 il y a 3 minutes, Lilou a dit : les plasmides c'est l'horreur Pour les exercices comme ca avec les plasmides, faut dessiner comme je t'ai fais au dessus, ca prend un peu de temps au début mais faut s'entraîner et après tu verras les items ca ira vite tout sera visuel avec ton plasmide recombinant dessiner. cassolnousmanque and Lilou 2 Quote
cassolnousmanque Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 (edited) il y a 7 minutes, Juliette82 a dit : Pour les exercices comme ca avec les plasmides, faut dessiner comme je t'ai fais au dessus, ca prend un peu de temps au début mais faut s'entraîner et après tu verras les items ca ira vite tout sera visuel avec ton plasmide recombinant dessiner. oui je suis d'accord, au début ça parait un peu flou mais c'est souvent les mêmes questions donc ça devient un automatisme Il y a 20 heures, Charette a dit : on a un Not 1 à 800 pb, un Pst1 à 1150 pb, et ensuite, SI L'INSERT EST DANS LE BON SENS, on a une autre Not1 à 3000 + 200 pb = 3200 pb, et un autre Pst1 à 3000 + 300 pb = 3300 pb. alors @Lilou je suis d'accord pour ça mais j'avais pas expliqué ça comme ça je vais retrouver ce que j'avais écrit (ça arrive à la même chose que @Juliette82 au final mais peut être que tu comprendras mieux) Not1 est à 300 pb de HindIII car dans le plasmide pPROM tu vois que HindIII est à 1500 pb et Not1 est à 1800 pb => 1800-1500 = 300 pb - Pst1 est à 400 pb de HindIII (1900 - 1500 = 400 pb) On insère le fragment au niveau de HindIII qui est à 2900 pb dans le plasmide phospho (ça c'est d'après l'énoncé c'est pas moi qui l'ai calculé ) donc à ce niveau tu vas regarder les résultats que tu as trouvé à l'étape d'avant dans le nouveau plasmide phospho APRES insertion : - Not1 est à 300 pb de HindIII => 2900 + 300 = 3200 => donc Not1 sera à 3200 pb dans le nouveau plasmide - Pst1 est à 400 pb de HindIII =>2900 + 400 = 3300 => donc Pst1 sera à 3300 pb dans le nouveau plasmide voila ce que j'avais expliqué, bon j'ai enlevé pas mal de lignes parce que c'était pas exactement la même question que la tienne mais normalement avec ça tu devrais comprendre d'où vient le 3200 et le 3300 pb Edited April 23, 2021 by cassolnousmanque Lilou and Juliette82 1 1 Quote
Lilou Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 il y a 12 minutes, Juliette82 a dit : alors je t'ai fais un dessin avec le plasmide recombinant et en rouge les croix où tu coupes du coup et en dessous les calculs. Pour le premier calcul tu fait la différence entre les deux sites de restrictions soit 3200 - 800 = 2400pb et pour le deuxième tu fais la taille totale du plasmide auquel tu soustrait ton premier fragment et ca donne 1900pb Oh merci bcp c'est parfait ça, bon beh du coup je pense que je prendrais le temps de dessiner la prochaine fois, merci Juliette82 1 Quote
cassolnousmanque Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 (edited) il y a 2 minutes, Lilou a dit : je pense que je prendrais le temps de dessiner la prochaine fois, merci oui dessine ton plasmide à chaque fois, en vrai on pense que c'est une perte de temps au début sauf qu'en fait je trouve que c'est plutôt le contraire parce qu'avec le dessin ça clarifie directement le problème, alors que sans le dessin tu dois réfléchir donc au final ça prend plus de temps après si tu veux gagner encore plus de temps, tu peux dessiner uniquement la partie qui est modifiée et pas le plasmide entier Edited April 23, 2021 by cassolnousmanque Juliette82 and Lilou 2 Quote
Lilou Posted April 23, 2021 Posted April 23, 2021 il y a 25 minutes, cassolnousmanque a dit : oui dessine ton plasmide à chaque fois, en vrai on pense que c'est une perte de temps au début sauf qu'en fait je trouve que c'est plutôt le contraire parce qu'avec le dessin ça clarifie directement le problème, alors que sans le dessin tu dois réfléchir donc au final ça prend plus de temps Merci cassolnousmanque 1 Quote
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