M20 - Plasmide

[l0veuse_2_coquillettes]

Coucouuu, j’espère que vous allez bien !

Voici l’énoncé du QCM qui me fait buguer https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/73ez.jpeg

et ici le QCM en question : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/u43h.jpeg

 

Après avoir regardé la correction du TD et la correction détaillée du TAT, je me demandais s’il fallait absolument que l’enzyme coupe dans la séquence d’intérêt sans être au milieu pour pouvoir évaluer le sens d’insertion ? Pourquoi ça ne marcherait pas ici dans ce cas avec l’enzyme qui coupe aux extrémités ? Comme on peut le voir dans la correction du Td, si le promoteur est mal inséré alors on verra la différence en coupant dans les 2 sens donc je ne comprends pas ...

voici la correction : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/zewl.jpeg

 

merciiiii 

[cassolnousmanque]

coucou @l0veuse_2_coquillettes, 

il y a 56 minutes, l0veuse_2_coquillettes a dit :

Voici l’énoncé du QCM qui me fait buguer https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/73ez.jpeg

et ici le QCM en question : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/u43h.jpeg

 

donc pour la question D si tu coupes par la même enzyme de restriction HindIII ici, le fragment peut se mettre dans les deux sens donc tu pourras pas savoir dans quel sens il est inséré => clonage non orienté 

 

voila j'espère avoir pu t'aider, si tu as d'autres questions n'hésite pas

bon courage pour cette derniere ligne droite

Edited April 15, 2021 by cassolnousmanque

[l0veuse_2_coquillettes]

@cassolnousmanque merci pour ton message, mais je ne comprends toujours pas ... si on coupe avec Bam H1 c’est pareil parce que selon le sens dans lequel on a inséré le promoteur, si on coupe par BamH1 dans le plasmide recombinant on obtiendra des fragments de tailles différentes en fait ? Pas du même nombre de pb que dans la correction du TD en coupant par HIND3 mais ça fera pareil, c’est ça que je comprends pas 

[cassolnousmanque]

il y a 47 minutes, l0veuse_2_coquillettes a dit :

@cassolnousmanque merci pour ton message, mais je ne comprends toujours pas ... si on coupe avec Bam H1 c’est pareil parce que selon le sens dans lequel on a inséré le promoteur, si on coupe par BamH1 dans le plasmide recombinant on obtiendra des fragments de tailles différentes en fait ? Pas du même nombre de pb que dans la correction du TD en coupant par HIND3 mais ça fera pareil, c’est ça que je comprends pas 

@l0veuse_2_coquillettesje vais te faire un dessin pour que ça soit plus clair 

 

edit: partie 1 : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/ugma.png

partie 2 : https://zupimages.net/viewer.php?id=21/15/bsh5.png

 

voila j'ai essayé de détailler mais si c'est toujours pas clair, dis moi j'essaierai de trouver un autre moyen 

 

en gros il faut pas confondre les enzymes par lesquelles tu coupes pour insérer et les enzymes avec lesquelles tu coupes pour voir si le vecteur est inséré dans le bon sens vu qu'ici on a un clonage non orienté 

 

après si dès le départ c'était 2 enzymes différentes, y aurait pas de problème puisque le fragment ne pourrait se mettre que dans un seul sens et on aurait un clonage orienté 

Edited April 16, 2021 by cassolnousmanque

[AthosPorthosAramisDartos]

Salutation,

Comme l'a dit @cassolnousmanque il s'agit ici d'un clonage non-orienté.
La ligation se fait avec 2 éléments : le vecteur PCOV sans le promoteur eucaryote, et le promoteur procaryote issu de la digestion du vecteur pPROM par HindIII.
A partir de là on aura 3 résultats possible : un vecteur PCOV sans promoteur refermé sur lui-même ; un vecteur pCOV-PRO avec le promoteur procaryote inséré dans le mauvais sens et enfin un vecteur pCOV-PRO avec le promoteur dans le bon sens.

Dans un premier temps, pour sélectionner ceux qui ont bien été inséré avec le promoteur procaryote on va faire une digestion par hindIII, 2 fragments pour ceux qui ont reçu l'insert et 1 seul pour ceux qui ne l'ont pas. donc : "l'utilisation de l'enzyme hindIII permet d'identifier les plasmides contenant le promoteur procaryote" : vrai.

Ensuite pour identifier ceux dont l'insertion s'est fait dans le bon sens ou dans le mauvais sens, il nous faut faire la digestion de pCOV-PRO avec des enzymes dont un des sites de restrictions se trouvt à l'intérieur même du promoteur procaryote. Donc pstI ou, comme tu l'as dis : bamHI. Cette digestion par une de ces enzyme entrainera l'apparition de 2 fragments dont la taille est prévisible et attendu en fonction du sens de l'insertion.

Ok ?